1、背景:
　　 橘青霉(Penicillium citrinum)屬于子囊菌亞門,不整囊菌綱,散囊菌目,散囊菌科,青霉屬,是重要的工業(yè)生產菌株。美伐他汀(mevastatin)是橘青霉產生的重要次級代謝產物,這種聚酮類化合物是甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,通過競爭性結合HMG-CoA還原酶有效抑制膽固醇的生物合成。美伐他汀經過生物轉化后生產的他汀類藥物是臨床治療高膽固醇血癥的首選藥物。研究美伐他汀生物合成機制

2、和調控網絡有助于定向改造目的菌株,而這些研究首先需要建立一套穩(wěn)定高效的遺傳轉化方法。目前,常用的絲狀真菌遺傳轉化方法有:CaCl2-PEG介導的原生質體轉化法、電擊轉化法、醋酸鋰轉化法、基因槍轉化法和限制性內切酶介導的轉化法等。由于絲狀真菌的復雜性,其遺傳轉化體系有別于植物細胞、動物細胞和原核生物,因此至今仍有許多種類的絲狀真菌未能建立合適的遺傳轉化體系,以至無法進行深入研究。根癌農桿菌介導的絲狀真菌轉化(Agrobactirium t

3、umfacience mediated-transformant)由于具有轉化效率高、操作簡便、受體廣泛、單拷貝插入和遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢在很多絲狀真菌中得到應用,但在橘青霉中的應用尚未有報道。因此我們選擇根癌農桿菌介導的方法來構建橘青霉遺傳轉化體系。
　　 目的:
　　 本文旨在建立一套能夠在橘青霉中實現(xiàn)高效穩(wěn)定運行的遺傳轉化系統(tǒng),為實驗室橘青霉的美伐他汀生物合成機制和全局性調控研究奠定方法基礎。
　　 方法:

4、>　　 1、利用重組DNA技術構建含Pci-laeA的重組質粒載體,探討抗生素選擇、孢子濃度、根癌農桿菌種類、根癌農桿菌濃度、乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間以及共培養(yǎng)方式等因素對根癌農桿菌介導的橘青霉遺傳轉化的影響,篩選優(yōu)化出合適的轉化條件。
　　 2、通過PCR技術擴增橘青霉基因組中增潮霉素B抗性標記基因(Hygromyem Bresistence gene)篩選驗證陽性轉化子,并在無潮霉素B(Hygromycin

5、B)篩選壓力的平板上連續(xù)傳代考察其遺傳穩(wěn)定性。
　　 3、對穩(wěn)定遺傳的轉化子進行表型觀察,并利用HPLC方法測定發(fā)酵液中美伐他汀生物合成量。
　　 結果:
　　 1、實驗結果顯示使用50μg/ml的潮霉素B能夠篩選到陽性轉化子,500μg/ml的頭孢噻肟鈉可以有效清除殘余根癌農桿菌。孢子濃度以107個/ml為佳;農桿菌LBA4404的轉化效率略高于EHA105,采用濃度為OD600≈0.8左右的根癌農桿菌效率較好

6、;乙酰丁香酮的最佳濃度為80μg/ml;24℃下共培養(yǎng)36h-48h時效率最高;液體共培養(yǎng)技術簡便有效。
　　 2、利用PCR技術成功從轉化子中擴增出hyg抗性標記基因,陽性轉化子篩選成功。在無Hyg篩選壓力的連續(xù)5次傳代下,90%的轉化子可以穩(wěn)定遺傳。
　　 3、表型觀察的結果發(fā)現(xiàn),野生型橘青霉與Pci-laeA基因轉化株相比其菌絲由淡黃色變成灰白色,孢子和菌絲形態(tài)無顯著改變。
　　 4、美伐他汀產量檢測結果顯