1、本項研究在已經(jīng)建立的富有柿葉片的高頻再生體系的基礎(chǔ)上，對影響根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)富有柿葉片遺傳轉(zhuǎn)化的條件進行了探索。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，建立了富有柿葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系；PCR檢測結(jié)果初步表明，已獲得了ACC合成酶的RNAi的轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下： 1.研究了選擇抗生素壯觀霉素和抑菌劑頭孢霉素對葉片直接分化不定芽的影響。結(jié)果表明，葉片外植體對壯觀霉素非常敏感，在分化培養(yǎng)基中附加3

2、0 mg/L的壯觀霉素即可完全抑制不定芽的分化：在生根試驗中，確定Sp生根壓力為20 mg/L。頭孢霉素葉片外植體的分化沒有嚴(yán)重影響，300 mg/L的頭孢霉素就能較好的抑制農(nóng)桿菌的生長，且不定芽誘導(dǎo)率可達到46.3％. 2.建立了以富有柿葉片為轉(zhuǎn)化受體的根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，詳細探討了預(yù)培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)時間、侵染菌液濃度、侵染時間、AS濃度等因素對于T-DNA轉(zhuǎn)化的影響，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果表明，選擇預(yù)培養(yǎng)3 d的葉片，用

3、OD<,600>為0.4的菌液侵染7 min后，轉(zhuǎn)到1/2MS+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+AS 150 umol/L的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4 d，再通過延遲篩選4 d，可獲得較好的轉(zhuǎn)化效果，抗性芽率最高的可達13.64.％。 3.通過建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得246株抗性苗，其中4株經(jīng)PCR檢測呈陽性。 4.研究了暗培養(yǎng)時間、蔗糖濃度、光照強度、閉瓶鍛煉時間對培育富有柿健壯生根苗的效果。結(jié)果表明，在蔗糖濃

4、度為20 g/L的培養(yǎng)基中生長的試管苗，暗培養(yǎng)8 d，在30 000 1x的光照下，閉瓶鍛煉21 d，對富有柿培育健壯生根苗有很大的促進作用。此條件下，培育的生根苗較好：生根率高，根系發(fā)達，試管苗生長健壯，芽點飽滿。 5.初步探討了溫度、濕度和移栽基質(zhì)對移栽成活率的影響，生根試管苗移栽到以蛭石：珍珠巖=1:1的基質(zhì)中，進行過渡移栽。保持小拱棚溫度在25～30℃。移栽前10 d，保持棚內(nèi)濕度在90％～100％，能獲得較好的移栽成活