1、目的：
　　單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）是指基因組中由單個(gè)核苷酸突變而引起的多態(tài)性變化，即基因組內(nèi)某一特定位點(diǎn)的核苷酸存在不同堿基差異的現(xiàn)象，在已知的DNA多態(tài)性中占大約90％，大多數(shù)位點(diǎn)為二等位基因，也存在一些三等位基因。對(duì)于SNPs的研究是繼限制性酶切片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、可變串

2、聯(lián)重復(fù)序列(variablenumber of tandem repeat，VNTR)和微衛(wèi)星多態(tài)性（microsatellite polymorphism）的之后的更深層次的基因多態(tài)性研究。自從1994年第一次被提出之后，如今已成為臨床及藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要研究對(duì)象，成為表觀遺傳學(xué)、重大疾病患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、基因靶向治療、腫瘤多藥耐藥機(jī)制等領(lǐng)域的熱門研究方向。
　　化療是臨床治療惡性腫瘤的重要手段之一。化療的成功與否關(guān)系著手術(shù)方案的制

3、定及術(shù)后的最終效果。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性(multi-drug resistance，MDR)的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。在對(duì)多藥耐藥基因SNPs的研究中，已經(jīng)確認(rèn)基因ABCB1的兩個(gè)位點(diǎn)C3435T和G2677T/A的多態(tài)性與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，其中C3435T位點(diǎn)的多態(tài)性還與某些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如乳腺癌、大腸癌等。基因ABCG2編碼的BCRP蛋白是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的成員之一，以“藥泵”形式減少胞內(nèi)ATP依賴性

4、藥物蓄積，與多藥耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。有研究顯示，ABCG2基因421 C＞A突變與BCRP表達(dá)低水平相關(guān)。由此可見，多藥耐藥基因關(guān)鍵SNPs位點(diǎn)的突變能夠顯著影響細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生及一些惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)。能夠準(zhǔn)確、快速、高通量的檢測(cè)多藥耐藥基因關(guān)鍵SNPs位點(diǎn)的基因型，對(duì)于個(gè)體化治療方案、腫瘤等多種疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)及對(duì)SNPs進(jìn)行更深入的研究均具有重要作用。
　　目前SNPs分型技術(shù)眾多，主要有限制性內(nèi)切酶酶切法（PCR-

5、RFLP法）、SNPshot、質(zhì)譜、PCR引物錯(cuò)配、Taqman探針?lè)?、分子信?biāo)法、高分辨率熔解曲線法(HRM)，焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)、InvaderrM、SNPlexl和基因芯片等方法。其中PCR-RFLP法和Taqman探針?lè)óa(chǎn)作為經(jīng)典技術(shù)常被用于實(shí)驗(yàn)室條件下的基礎(chǔ)研究，焦磷酸測(cè)序技術(shù)被視為目前基因測(cè)序的“金標(biāo)準(zhǔn)”，基因芯技術(shù)近幾年得到了高速發(fā)展，其最大特點(diǎn)是具有高通量的特性，一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)幾十萬(wàn)個(gè)SNPs

6、位點(diǎn)，是大規(guī)模關(guān)聯(lián)分析最主要的手段。這些SNPs分析技術(shù)在不同的條件下發(fā)揮著各自的優(yōu)勢(shì)，但也存在著一些不足，比如操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、高成本及嚴(yán)重依賴大型檢測(cè)設(shè)備等弊端都限制了這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著新型非天然核苷酸的不斷出現(xiàn)及納米技術(shù)的迅猛發(fā)展及，SNPs基因分型技術(shù)也不斷改良。
　　鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)作為一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，其戊糖環(huán)的2'-O和4'-C間形成一個(gè)甲基橋結(jié)構(gòu)

7、，這一結(jié)構(gòu)降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，形成了剛性的縮合結(jié)構(gòu)。這種雙環(huán)結(jié)構(gòu)使LNA與互補(bǔ)序列雜交時(shí)具有更高的熱穩(wěn)定性，攜帶一個(gè)LNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)比普通的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)Tm值高出7-9℃;而與單堿基錯(cuò)配的序列雜交時(shí)形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)也比普通的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)更不穩(wěn)定。因此，LNA修飾的寡核苷酸探針比DNA寡核苷酸具有更高的特異性，使其在基因表達(dá)檢測(cè)及SNP分型技術(shù)中有著良好的應(yīng)用研究前景。
　　磁性微粒(

8、Magneticparticles)，又稱磁珠，構(gòu)成元素包括磁性金屬如Fe、Co、Ni或其金屬氧化物等，這些磁性金屬或其金屬氧化物的納米級(jí)粒子與高分子或無(wú)機(jī)材料等形成的一種膠態(tài)液體復(fù)合物，統(tǒng)稱為納米磁微粒。其中Fe3O4的納米粒子理化性質(zhì)穩(wěn)定，制備方法成熟，除了具有普通納米微粒的理化屬性外，還具有超順磁性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)其表面進(jìn)行功能化修飾，F(xiàn)e3O4的納米粒子作為目標(biāo)物載體可在外加磁場(chǎng)的作用下快速移動(dòng)和分離，已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域新的研

9、究手段用于核苷酸片段、靶蛋白及靶細(xì)胞的高特異性分離、純化及篩選。
　　基于本領(lǐng)域已有的研究基礎(chǔ)，本研究設(shè)計(jì)開發(fā)了三種新的SNPs檢測(cè)方法。分別是基于納米磁載體的酶聯(lián)反應(yīng)用于檢測(cè)基因ABCB1 G2677T/A的單核苷酸多態(tài)性;基于鎖核酸探針及鹽誘導(dǎo)效應(yīng)的雜交體系用于室溫下檢測(cè)ABCB1C3435T單核苷酸多態(tài)性;基于鎖核酸修飾的分子信標(biāo)二聯(lián)體用于室溫下檢測(cè)ABCG2 C421A單核苷酸多態(tài)性。主要用于室溫下準(zhǔn)確、快速、高通量檢測(cè)多

10、藥耐藥基因SNPs關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　方法：
　　1.本研究采用碘化鉀法從抗凝血漿樣本中提取全基因組DNA。樣本來(lái)自2008年1月～2012年7月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院進(jìn)行住院治療及同期在同一醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康體檢且體檢結(jié)果正常、無(wú)腫瘤病史及遺傳病史且年齡、性別分別與病例組相匹配的健康志愿者人群。
　　2.引物設(shè)計(jì)與合成均根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov

11、/snp/)中提供的基因序列，采用PubMed在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools)及Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物和探針序列。利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)中的引物BLAST工具（http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列對(duì)比，確定引物的準(zhǔn)確度及特異性。根據(jù)基因的目標(biāo)序列和所選擇的多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物序列及目的條帶長(zhǎng)度。
　　3.本研究

12、第一部分采用EDC/NHS法對(duì)羥基-納米磁顆粒進(jìn)行表面活化，再與5′端修飾氨基的寡核苷酸偶聯(lián);第二部分和第三部分采用EDC一步法活化法偶聯(lián)鏈霉親和素(SA)，再與5'端修飾生物素的寡核苷酸偶聯(lián)。最后均分散于含有0.05％ NaN3和1％ BSA的pH7.4的PBS中，4℃保存。
　　結(jié)果：
　　1.基于納米磁載體的酶聯(lián)反應(yīng)用于檢測(cè)基因ABCB1 G2677T/A的單核苷酸多態(tài)性。
　　(1)納米磁珠與捕獲探針偶聯(lián)效率:

13、根據(jù)公式計(jì)算出納米磁珠與捕獲探針的偶聯(lián)效率為95.87％;
　　(2) ABCB1 G2677 T/A有三種SNP亞型，信號(hào)探針?lè)謩e與3種模板進(jìn)行酶聯(lián)反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察到3條信號(hào)探針均只在完全互補(bǔ)模板存在時(shí)檢出熒光，與單堿基錯(cuò)配模板的雜交后未檢出熒光。
　　(3)瓊脂糖電泳結(jié)果顯示在150-200 bp之間有唯一PCR產(chǎn)物條帶，無(wú)雜帶出現(xiàn)，是173 bp的目的DNA。
　　2.基于鎖核酸探針及鹽誘導(dǎo)效應(yīng)的雜交體系

14、在室溫下檢測(cè)ABCB1 C3435T單核苷酸多態(tài)性。
　　(1)發(fā)現(xiàn)不同鈉離子Buffer中LNA-probe與不同模板的HRM曲線不同，總體呈現(xiàn)兩種形狀。一種是正常的“S”型HRM曲線，LNA-probe在低鈉離子濃度Buffer中與兩種模板生成的曲線均為這種形態(tài)，而當(dāng)鈉離子濃度介于兩者之間時(shí)，在同一Buffer中LNA-probe與兩種模板的HRM曲線發(fā)生了顯著的“分離”傾向:SM模板與探針生成的曲線形態(tài)接近前者，互補(bǔ)模板與探

15、針生成的曲線形態(tài)接近后者，序列相同的DNA-probe與兩種模板在任一鈉離子濃度Buffer中均未顯示出HRM曲線“分離”的傾向，[Na+]為0.25 M和0.5 M的條件下均有此現(xiàn)象發(fā)生;
　　(2)加入甲酰胺后，探針與模板的HRM曲線向低溫方向發(fā)生平移，平移距離與甲酰胺用量成正比;
　　(3)溫度波動(dòng)對(duì)探針準(zhǔn)確度影響的考察結(jié)果為在20℃、25℃、30℃溫度下探針準(zhǔn)確率為100％;在15℃下，探針的準(zhǔn)確率為80％，出現(xiàn)了一

16、次假陽(yáng)性;在35℃下，探針的準(zhǔn)確率為60％，出現(xiàn)了2次假陰性;
　　結(jié)論：
　　1.方法一可以用于檢測(cè)基因ABCB1 G2677T/A的單核苷酸多態(tài)性;
　　2.納米磁微粒具有物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，粒徑小易分散，比表面積大，超順磁性等特點(diǎn)，寡核苷酸探針與其偶聯(lián)后，可大幅提高固液兩相界面的DNA雜交速率，并能夠快速純化目的產(chǎn)物，非常適合作為載體用于體外診斷試劑的研發(fā);
　　3.T4 DNA連接酶催化的鏈連接專一快速，

17、適用于催化溫度在15-25℃之間的DNA雜交反應(yīng);
　　4.方法二可以在室溫下快速檢測(cè)基因ABCB1 C3435T的SNP。
　　5.LNA能夠提高Tm值，LNA探針比普通DNA探針特異性更強(qiáng)。
　　6.基于低鹽誘導(dǎo)效應(yīng)的雜交體系，具有選擇性誘導(dǎo)LNA-DNA雜交的能力，增強(qiáng)探針對(duì)單堿基錯(cuò)配的識(shí)別能力;
　　7.方法三可以用于室溫下檢測(cè)基因ABCG2 C421A的單核苷酸多態(tài)性;
　　8.首創(chuàng)“啞鈴型”分子