1、背景與目的: 毛孢子菌病(trichosporonosis)是由毛孢子菌屬引起的毛發(fā)、指(趾)甲、皮膚以及系統(tǒng)性感染的真菌病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣。1970年Watson等報道了世界首例毛孢子菌病，2001年楊蓉婭等報道了國內(nèi)首例播散性毛孢子菌病，近年來，毛孢子菌病的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢，這主要和惡性腫瘤的增加，接受器官移植人群增多，免疫抑制療法、化學(xué)療法、廣譜抗菌素以及侵入性醫(yī)療操作的廣泛應(yīng)用等因素有關(guān)。 目前，可以引

2、起人類感染的毛孢子菌主要包括以下幾種：皮膚毛孢子菌(Tcutaneum)、阿薩希毛孢子菌(T.asahii)、星形毛孢子菌(T.asteroids)、皮瘤毛孢子菌(T.inkin)、黏液樣毛孢子菌(T.mucoides)、卵形毛孢子菌(T.ovoides)、T.jirovecii、T. dermatis、T.domesticum、T. montevideense.T.japonicum、T. coremiiforme、T.faecali

3、s和T. loubieri等。其中阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii，T.asahii)是毛孢子菌病及非念珠菌屬真菌血癥最主要的病原菌，T. asahii引起的感染可以累及到多個器官，且難以診斷和治療。隨著由T. asahii引起的毛孢子菌病病例的增加，.臨床醫(yī)生須對其加以足夠的重視，特別是對那些免疫缺陷的宿主，由于可以引起致命性的感染，更應(yīng)提高警惕。 基因序列多態(tài)性是真菌菌株的重要特征，基因多態(tài)性研究是微生

4、物流行病學(xué)研究的重要方法之一，借此研究可以從基因水平確定菌株間的親緣關(guān)系。微生物分型對于社區(qū)和醫(yī)院感染性疾病的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測、傳播途徑的了解和阻斷、以及發(fā)病機理的研究，都極為重要。而T. asahii基因多態(tài)性及基因型的研究對于該菌的流行病學(xué)、發(fā)病機制以及治療的研究都有著重要的指導(dǎo)意義。研究表明，毛孢子菌屬具有種間的多態(tài)性和遺傳差異；不同國家、地區(qū)來源的T.asahii其IGS1區(qū)的基因型不完全相同；從表皮分離與從血液和黏膜等不同部

5、位分離的Tasahii ITS區(qū)的基因型也不同；從不同的樣本、環(huán)境中分離Tasahii的遺傳差異以及生物學(xué)特性也不盡相同。目前對中國Zasahii菌株種內(nèi)是否具有多態(tài)性和遺傳差異尚不清楚。國內(nèi)臨床分離的5株Tasahii分離部位、地域及其引起的感染類型均不相同，而他們是否屬于不同基因型以及這些不同與基因型間是否具有一定的相關(guān)性，尚無研究報道。限制性片段長度多態(tài)性分析( RFLP)方法是近年發(fā)展起來的基因檢測與分型技術(shù)，也是分析生物體基因

6、結(jié)構(gòu)最為經(jīng)典的方法之一，而目前在T. asahii基因多態(tài)性研究中尚未得到應(yīng)用。 本研究首次應(yīng)用PCR-RFLP方法對國內(nèi)臨床分離5株T.asahii的ITS及IGS1區(qū)是否具有種內(nèi)基因多態(tài)性進行探索性研究，分析ITS及IGS1區(qū)在T.asahii種內(nèi)的進化差異，探討PCR-RFLP方法在T.asahii種內(nèi)基因多態(tài)性研究中的可行性。同時根據(jù)IGS1區(qū)基因序列對其進行基因型分析，明確國內(nèi)5株T.asahii分離株的基因型及分布特

7、點，為進一步探討國內(nèi)T. asahii感染引起的毛孢子菌病的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測、傳播途徑的了解和阻斷、發(fā)病機理的研究以及T.asahii菌株間的遺傳關(guān)系、分布特點，分離部位、地域及菌株的致病性與基因型的關(guān)系研究提供一定的理論依據(jù)。 研究方法: 以國內(nèi)臨床分離5株T.asahii為主要研究對象，1株T.asahii標準株作對照( CBS2479r)。用玻璃珠法分別提取臨床分離株及標準對照株的總DNA，特異性引物對其核糖體R

8、NA( rRNA)的ITS和IGS1區(qū)域進行PCR擴增，分別用限制性內(nèi)切酶HinfI、Hap II、Mbo I、Alu I、Hha I、Nco I對ITS、IGS1區(qū)PCR產(chǎn)物進行酶切，用RFLP方法對酶切結(jié)果進行分析。對ITS和IGS1區(qū)的PCR產(chǎn)物進行純化、克隆、測序，并將結(jié)果提交到Genbank，獲取登錄號。用Clustal x軟件對測序結(jié)果進行多重比對分析，尋找堿基突變位點，根據(jù)IGS1序列區(qū)，將不同國家來源的不同基因型的T.a

9、sahii一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對國內(nèi)臨床分離5株T. asahu進行基因型分析。 結(jié)果: 1.所有菌株ITS、IGS1區(qū)均擴增、克隆、測序成功，ITS區(qū)長度均為541bp，IGS1區(qū)長度均為643bp，ITS區(qū)序列完全相同，IGS1區(qū)序列部分菌株的堿基發(fā)生突變，其中菌株BZP07002在449bp(T→C)、561bp(A→T)位點處堿基發(fā)生突變；BZP07003在129bp(A→G)、178bp(C→T)、204bp(

10、T→C)、223bp(G→A)、451bp(A→T)位點處堿基發(fā)生突變；BZP07004在333bp(A→G)位點處堿基發(fā)生突變。 2.6株Z asahii ITS區(qū)在同一種限制性內(nèi)切酶酶切下，酶切結(jié)果均無差異。6株T。asahii IGS1區(qū)酶切出現(xiàn)3種不同的圖譜，其中T.asahii BZP07003經(jīng)Hap II酶切結(jié)果與其它5株菌不同，T. asahii BZP07004經(jīng)Hha I酶切結(jié)果與其它5株菌不同，IGS1區(qū)在

11、同一種限制性內(nèi)切酶Hinf I、Mbo I、Alu I、Nco I內(nèi)，6株菌酶切結(jié)果無差異。 3.T. asahii BZP07001、BZP07005在系統(tǒng)發(fā)生樹的同一個分枝中，屬于基因型1，BZP07003在另一個分枝中，屬于基因型4，T.asahii BZP07002和BZP07004分別獨立形成一個分枝，與其它任何基因型均不同，為我們新發(fā)現(xiàn)的基因型，分別命名為基因型7和基因型8。 結(jié)論: 1.國內(nèi)臨床分離

12、的5株T.asahii IGS1區(qū)具有種內(nèi)基因多態(tài)性和遺傳差異，ITS區(qū)目前在國內(nèi)菌株中未發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性。在Tasahii菌株中，IGS1區(qū)比ITS區(qū)差異明顯，進化更快。 2.PCR-RFLP分析方法以及限制性內(nèi)切酶Hha I和Hap II可用于Tasahii IGS1區(qū)基因多態(tài)性的分析研究。 3.國內(nèi)臨床分離5株Tasahii分屬4個基因型，其中T.asahii BZP07001、BZP07005屬于基因型1；T.as