1、凝集素表現(xiàn)出很多的活性，包括抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)，抗真菌，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制，和抗蟲的性質(zhì)等，有些還顯示出抗菌和抗線蟲的性質(zhì)，在實(shí)際中有很大的應(yīng)用前景。但是從原材料中提取純化耗時費(fèi)力，受原材料來源的限制，產(chǎn)量不高。使用大腸桿菌表達(dá)中國水仙凝集素的結(jié)果表明，重組蛋白較大一部分是以包涵體形式存在的，所以本論文研究了中國水仙凝集素在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達(dá)。
　　 本研究首先將中國水仙凝集素基因克隆到pPIC9K-T載體（本實(shí)驗室構(gòu)

2、建）上，成功構(gòu)建了畢赤酵母GS115 pPIC9K-NTL，但是SDS-PAGE電泳沒有檢測到明顯的蛋白表達(dá)。通過對稀有密碼子的檢查，檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)有使用頻率為10-20％的密碼子17個，使用頻率為10％密碼子18個，因此利用DNA Works等軟件合成了偏好于畢赤酵母的新凝集素基因（NTL-opt）。將優(yōu)化后的水仙凝集素基因NTL-opt與pPIC9K-T載體連接，成功構(gòu)建進(jìn)畢赤酵母中，使用MD缺陷型培養(yǎng)基篩選，再使用PCR的方法進(jìn)行驗

3、證酵母基因組，結(jié)果顯示6個轉(zhuǎn)化子中有3個為陽性，成功得到重組畢赤酵母GS115(pPIC9K-NTL-opt)。
　　 挑取一株單克隆重組畢赤酵母GS115(pPIC9K-NTL-opt)，使用BMGY/BMMY有機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果顯示蛋白得到了成功表達(dá)。簡單對比了有機(jī)培養(yǎng)基和無機(jī)培養(yǎng)基的表達(dá)，蛋白產(chǎn)量并沒有明顯差異，因此選用無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為后期上罐發(fā)酵的培養(yǎng)基。使用band

4、scan等軟件計算得到目標(biāo)蛋白占總蛋白含量的80％以上。
　　 重組凝集素的性質(zhì)研究顯示，與天然凝集素凝集活性4.76相比，重組水仙凝集素凝集活性為4.39，凝集活性相近;使用圓二色譜的方法分別測定天然和重組凝集素的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示二者二級結(jié)構(gòu)相似;對重組凝集素進(jìn)行去糖基化研究，結(jié)果顯示重組蛋白沒有明顯的糖基化作用。以上結(jié)論表明，重組水仙凝集素與天然水仙凝集素性質(zhì)相似。
　　 在重組水仙凝集素畢赤酵母菌株構(gòu)建成功及蛋白

5、初步表達(dá)成功的基礎(chǔ)上，使用5L的發(fā)酵罐進(jìn)行了簡單的發(fā)酵表達(dá)，發(fā)酵的基本條件為pH5.6，溫度28℃，轉(zhuǎn)速600rpm。研究了發(fā)酵過程中菌濃度，甘油濃度，銨離子濃度的變化。菌體在甘油為碳源的條件下生長迅速，加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后生長較緩慢，菌濃度在發(fā)酵罐中可以達(dá)到OD600為290。初始甘油濃度為30g/L，在20h急速下降，40h時基本耗盡，也是此時開始加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。中國水仙凝集素在此次表達(dá)中達(dá)到了較高的表達(dá)量，發(fā)酵液中的總蛋白含量