1、人的胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ是存在于人體多種組織中的具有多種重要生理功能的細(xì)胞因子。它的缺乏會(huì)導(dǎo)致多種嚴(yán)重的疾病。因而它也成為具有多種治療用途的藥物。本研究目的是利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效地表達(dá)這種蛋白。 本研究利用PCR引入突變的方法成功地改造胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ的基因序列以滿足畢赤酵母對(duì)密碼子的偏好性，以期提高其在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平。成功地將改造過的人胰島素樣生長(zhǎng)因子基因定向克隆到畢赤酵母表達(dá)載體上。把構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)

2、入巴斯德畢赤酵母中，經(jīng)歷組氨酸缺陷培養(yǎng)基的篩選和含有不同濃度G418的培養(yǎng)基的多次篩選，獲得9個(gè)能在含5.0mg/mlG418YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)克隆。PCR鑒定表明：胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ基因已經(jīng)成功地整合進(jìn)入畢赤酵母GS115的基因組中。挑選其中的1個(gè)克隆在恒溫振蕩器實(shí)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別在第48、72、96、120小時(shí)取上清，用硫酸銨沉淀蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE電泳顯示：表達(dá)的外源蛋白與目標(biāo)蛋白大小一致。Westernbloting表明它