1、乙型肝炎是由乙肝病毒（HBV）感染引起的一種傳染性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報道，全球約有2.4億的乙型肝炎慢性感染者（乙肝表面抗原陽性持續(xù)至少6個月），每年有超過68.8萬人死于慢性乙肝的并發(fā)癥，包括肝癌和肝硬化。乙肝疫苗的應用雖能預防乙型肝炎病毒的傳播，但對于乙型肝炎的治療仍然面臨諸多問題。一般認為，徹底清除宿主細胞內乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA（HBV cccDNA）是治愈乙肝的標準，然而目前常用的各種抗病毒療法均未能實現(xiàn)這一目的。最

2、近出現(xiàn)的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas9系統(tǒng)，因可以對任何物種基因組進行 DNA的定點編輯且較先前的基因編輯技術更為簡單、快捷、高效，已為諸多難以實現(xiàn)根治的病毒性感染、遺傳病以及染色體缺陷等疾病的治療帶來了曙光。
　　截至目前，包括本課題組在內的前期研究均已成功利用 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在HBV細胞模型及HBV高壓水動

3、力小鼠模型中實現(xiàn)了對HBV復制與表達的高效抑制，從理論上證明了CRISPR-Cas9在清除乙肝病毒感染上的巨大應用價值。然而在對于相比以上模型更接近臨床患者的體內模型HBV轉基因小鼠來說，已有的方法均未取得明顯的效果，主要是由于缺乏高效安全的基因轉運載體。目前廣泛使用的 CRISPR-Cas9系統(tǒng)為來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR-SpCas9，這種 CRISPR-SpCas9系統(tǒng)雖能利用慢病

4、毒或腺病毒作為基因轉運載體，但這些載體病毒過高的免疫原性及易整合至宿主細胞基因組等缺陷大大限制了 CRISPR-Cas9技術在基因治療上的應用。新型重組腺相關病毒載體（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）雖然被認為是最理想的基因治療載體，但 CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的 SpCas9及必需控制元件的體積（7kbp）超過了rAAV的容量（4.5kbp），并不能利用rAAV包裝完整的CRISPR

5、-Cas9系統(tǒng)。2015年5月，美國麻省理工大學的張峰實驗室發(fā)現(xiàn)了一種小型化的產自金黃色葡萄球菌的CRISPR-SaCas9（Staphylococcus aureus Cas9）系統(tǒng)，并成功利用rAAV介導該系統(tǒng)在體內對相應基因進行編輯。本次研究旨在利用重組腺相關病毒（rAAV）介導CRISPR-SaCas9系統(tǒng)（rAAV::CRISPR-SaCas9）實現(xiàn)對HBV轉基因小鼠體內HBV的復制與表達的高效抑制。同時進一步探究rAAV8:

6、:CRISPR-SaCas9系統(tǒng)在HBV轉基因小鼠體內抑制HBV復制與表達過程中的有效劑量、持續(xù)時間、抑制效果、對HBV DNA的剪切效率、脫靶效應以及對動物可能造成的相關損傷等方面的問題。
　　1.篩選適用于CRISPR-SaCas9系統(tǒng)的高效HBV靶點。本課題組在前期的研究中成功利用 CRISPR-SpCas9抑制了 HBV細胞模型及HBV高壓水動力小鼠模型中HBV的復制與表達。然而，與CRISPR-SpCas9靶點需要的PA

7、M限制基序“NGG”不同，CRISPR-SaCas9靶點需要的PAM基序為“NNGRRT”。在缺乏gRNA靶點預測工具的情況下，需要對靶向HBV的靶點進行設計篩選。
　?。?）建立新的HBV靶點設計方法。為了得到適用于不同HBV基因型的SaCas9高效靶點，我們首先選取了26種不同基因型不同地區(qū)來源的 HBV（A-G），并對這些不同類型 HBV的基因組進行序列比對。再利用Vector NTI Advance11.5.1軟件在高度保

8、守基因區(qū)域的正負雙鏈查找出含PAM基序“NNGRRT”的位點。通過以上步驟，共找到21個符合要求的靶點。
　?。?）靶向HBV高效靶點的篩選。根據(jù)篩選出的靶點分別構建了21套相應的CRISPR-SaCas9表達載體，并將這些載體與含有HBV基因組的表達載體共轉入293T細胞中，通過對細胞上清中的HBV抗原及HBV DNA的含量的檢測及細胞活性的測定，分別評估帶有不同靶點的CRISPR-SaCas9系統(tǒng)對HBV的抑制效率及對細胞活性

9、的影響。經過上述篩選得到了對HBV抑制效率最高且對細胞活性沒有影響的gRNA-Sa4系統(tǒng)。此外通過T7EI酶切證實了含有該系統(tǒng)對細胞內HBV DNA的剪切。
　　2.利用rAAV8::CRISPR-SaCas9系統(tǒng)高效抑制HBV轉基因小鼠體內HBV的復制與表達
　　（1）利用VIII型重組腺相關病毒包裝CRISPR-SaCas9系統(tǒng)。不同血清型別的腺相關病毒具有不同的組織嗜性，其中 VIII型重組腺相關病毒（rAAV8）可以

10、特異地感染肝組織，對其他組織臟器的感染效率較低。為盡可能減少CRISPR-SaCas9系統(tǒng)對小鼠體內其他器官的影響，本研究選擇VIII型重組腺相關病毒（rAAV8）對CRISPR-SaCas9系統(tǒng)進行包裝。通過向HEK293細胞中同時轉染 CRISPR-SaCas9表達載體、包裝質粒 pAAV-RC和輔助質粒pHelper，成功將帶有高效靶向HBV靶點的CRISPR-SaCas9系統(tǒng)包裝入rAAV8病毒中。用氯仿純化法提純收集到的病毒，

11、根據(jù)點雜交實驗結果，純化后的病毒滴度達1×1012v.g./mL以上。
　?。?）HBV轉基因小鼠體內乙肝病毒復制的評估。經DNA測序及血清學檢測，本研究所用的HBV轉基因小鼠體內整合有1.28倍HBV全長基因組，血清中HBsAg的含量達到4,000-6,000 IU/mL， HBeAg的含量達到800-1,000 S/CO，HBV DNA含量超過108v.g./mL，并且可以在肝組織中檢測到HBcAg的表達。
　?。?）低

12、劑量rAAV8::CRISPR-SaCas9的抑制效果評估。根據(jù)已有文獻，首先測試了低劑量 rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒（5×1010v.g./只）對4-6周齡雄性HBV轉基因小鼠體內HBV的抑制效果。通過對病毒復制和表達的各項指標進行連續(xù)的監(jiān)測結果顯示，該劑量的 rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒并不能有效抑制HBV轉基因小鼠體內HBV的復制和表達。
　　（4）高劑量rAAV8::CRISPR-SaCa

13、s9抑制了小鼠體內的HBV的復制與表達。在將rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒劑量提高至2×1011v.g./只后，實驗組小鼠血清中HBV標志物的含量出現(xiàn)持續(xù)下降：在連續(xù)兩次注射后的第38天，實驗組小鼠血清中HBsAg、HBeAg的含量相比對照組分別下降62.96±7.59％和65.18±3.08%；血清中HBV DNA的含量相比對照組下降92.82±3.67%；通過對肝臟切片HBcAg免疫熒光結果的分析，我們發(fā)現(xiàn)全景掃描照片

14、可以看出實驗組 HBcAg的熒光強度顯著低于對照組，實驗組肝組織中 HBcAg的含量相比對照組下降76.88±18.39%，；通過肝組織病理學檢測，在對照組小鼠肝組織中觀察到了明顯的炎性浸潤和肝細胞腫大，然而實驗組小鼠肝組織中卻未觀察到相應的炎性病理改變。通過 T7EI酶切以及深度測序，證實了rAAV8::CRISPR-SaCas9對HBV轉基因小鼠肝臟中HBV基因組相應區(qū)域的剪切作用。此外，小鼠其他臟器的病理學檢測均未出現(xiàn)任何病理改變