1、當前醫(yī)學及生命科學研究中，動物模型是不可或缺的組成部分。生命科學研究中每一種模式動物研究的突破，為遺傳學、分子生物學、發(fā)育生物學等研究領域帶來了突破式的進展。隨著科學研究的不斷深入，人類對復雜生命現(xiàn)象的不斷探索，以及人類面臨的重大疾?。ò┌Y，艾滋病，心腦血管疾病，神經(jīng)性疾病等）的威脅，低等的動物模型已無法滿足復雜的科學研究以及模擬人類重大疾病的需求。非人靈長類動物作為人類的近親，具有與人類相似的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及代謝系統(tǒng)，是最理想的

2、甚至是唯一的模型動物。許多靈長類動物的研究成果可直接應用于人類疾病的預測、預防、診斷和治療，而這些方面一直是人類健康領域關注的焦點。目前，非人靈長類動物模型構建一直受到編輯效率低、操作困難等限制，這些困難成為制約非人靈長類動物模型研究的瓶頸。
　　近年來，基因編輯技術領域發(fā)展迅速，新型基因編輯工具不斷被開發(fā)，尤其是CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，使基因編輯技術進入了新的時代。目前基因工程定點基因編輯工具中，可設計目標序列

3、的定點核酸內切酶主要有三種，即:ZFN（鋅指核酸酶），TALEN（轉錄激活子樣效應因子核酸酶）和CRISPR/Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復/CRISPR相關蛋白9）系統(tǒng)。其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以其設計構建方便，敲除效率高，應用范圍廣等優(yōu)勢，被廣泛應用于基因編輯研究中。因此，對CRISPR/Cas9技術的改造優(yōu)化，并將其運用于構建非人靈長類動物基因編輯模型是生命科學所迫切需要的研究內容。
　　本文綜合運用CRISPR

4、/Cas9基因編輯系統(tǒng)，針對Nr0b1，Pparg-γ，Rag1三個基因共設計5個sgRNA，其中Nr0b1與早期性腺發(fā)育相關，Pparg-γ與脂肪代謝相關，Rag1與免疫系統(tǒng)相關。通過對食蟹猴受精卵一細胞時期顯微注射Cas9 mRNA與sgRNA的混合體系，移植入代孕猴，成功構建定點基因敲除猴。通過對流產猴配子的基因鑒定，確認CRISPR/Cas9引入的基因編輯可以傳遞于配子，提示該基因編輯可以傳遞給子代。接著，針對食蟹猴Oct4（P

5、ou5f1）基因3'UTR區(qū)設計sgRNA，并構建同源重組質粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm，通過對食蟹猴受精卵顯微注射Cas9 mRNA、sgRNA與供體質粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm混合體系，移植入代孕猴，利用細胞同源重組修復機制，將外源hrGFP定點插入目的基因Oct4的3'UTR區(qū)，成功獲得定點基因敲入食蟹猴。
　　在研究基因缺陷導致的疾病中，除基因缺失而直接影響基因表達以外，大數(shù)據(jù)的篩查結

6、果顯示，許多單核苷酸改變的多態(tài)性或突變位點，或者短的堿基插入刪除(Indel)也與多種疾病關聯(lián)。為了很好地模擬人類疾病的這類遺傳學改變，以及模擬該類致病突變位點的修復。本文利用單拷貝BFP基因的293T細胞系作為研究工具，優(yōu)化ssODN的設計方法。針對BFP與GFP差異位點附近設計不同的ssODN和sgRNA，利用重組后細胞熒光的比例來判斷重組效率。通過綜合比較不同的設計的ssODN，以及ssODN與sgRNA的不同位置組合，發(fā)現(xiàn)利用互

7、補鏈ssODN并且突變位點位于切口位置3'方向時，重組率相對較高。隨后，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，結合單鏈寡核苷酸供體(ssODN)進行小鼠胚胎共注射，利用ssODN作為同源重組模板，進行同源重組修復，成功構建了Usp42，Cep41，F(xiàn)bxo47三個定點突變小鼠模型，為非人靈長類動物模型基于ssODN的基因編輯奠定了基礎。
　　本研究將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)應用于非人靈長類動物——食蟹猴，結合顯微注射技術，成功

8、構建出定點基因編輯食蟹猴。通過對陽性流產猴配子的基因鑒定，提示CRISPR/Cas9技術產生的基因編輯在食蟹猴中可以傳遞給子代。利用CRISPR/Cas9技術結合同源重組技術，獲得了定點基因敲入食蟹猴。并利用細胞系和小鼠模型進一步優(yōu)化了以ssODN作為同源重組模板進行點突變模型構建中的設計方案，根據(jù)ssODN與sgRNA相對位置的不同設計分組實驗，發(fā)現(xiàn)ssODN的設計以及與sgRNA相對位置與重組效率有關，為進一步在靈長類模型的應用奠定