1、水稻是全世界食用人數(shù)最多的糧食作物，隨著世界人口不斷增長，水稻增產和品質性狀的改良日益成為育種家們關注的焦點。傳統(tǒng)育種手段基于雜交育種，耗時長且依賴育種家經驗，難以滿足性狀定向改良需求；物理、化學、航天誘變和生物等技術手段很難做到定點突變；轉基因手段尚未得到廣泛認可；傳統(tǒng)基因定點突變技術技術過程復雜且難以廣泛應用，因此，迫切需求建立安全、高效的目的基因定向改良技術流程，實現(xiàn)品種直接改良并提供可供育種利用的新種質。近年來，以CRISPR/

2、Cas9技術為代表的基因組定點編輯技術成為植物育種技術的研究新熱點，這為水稻種質資源創(chuàng)新提供了安全、高效的新途徑。CRISPR/Cas9技術只需設計一段與靶點配對的含20個堿基的核苷酸序列，操作簡單，實驗周期短，費用低，目前該技術已廣泛應用于微生物和動植物的基因編輯中，但目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻基因編輯上的研究和應用還不夠。
　　本研究利用CRISPR/Cas9技術定點編輯控制水稻千粒重基因TGW6和水稻堊白性狀基因

3、Chalk5，初步建立了基于 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的水稻基因定點編輯技術平臺，建立了穩(wěn)定可靠的水稻農藝性狀關鍵基因突變方法技術體系，并創(chuàng)制了一些具有重要價值的非轉基因水稻新種質和供水稻基礎研究的突變體，為重大水稻新品種的培育和基礎研究奠定基礎，具有重要的理論和實踐意義。主要研究成果如下：
　?。?）成功構建四靶點pLY CRISPR/Cas9-TGW6、pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1和pLY CRISPR/

4、Cas9-Chalk5-2雙元表達載體，通過農桿菌介導水稻成熟胚遺傳轉化，成功獲得一定數(shù)量的水稻H447、S95B和02428組培苗T0代。
　?。?）組培苗T0代打靶效果檢測，同個靶點在不同水稻和不同基因中突變效率并不十分一致，差別較大，且四靶點并不全部發(fā)生突變，統(tǒng)計顯示 T2靶點突變率最高?；駾NA序列突變類型主要有堿基缺失、錯配和插入，其中以堿基缺失和錯配為主。
　　（3）將pLY CRISPR/Cas9-TGW6載

5、體轉入秈稻S95B、pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1載體轉入秈稻S95B與H447和pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-2載體轉入粳稻02428當中，成功獲得組培苗，分別獲得轉基因T0代陽性植株為18、13、8和10株，其中發(fā)生突變植株分別有18、13、7和9株突變，突變率87.5-100％，發(fā)生雙等位突變分別有6、4、4和5株，純合突變分別有11、9、3和4株，雜合突變1株。
　?。?）對四個突變體株系

6、進行相應表型鑒定，結果顯示突變后代突變效果差異較大，相同基因系列發(fā)生突變后并沒有出現(xiàn)一致性的改變。轉pLY CRISPR/Cas9-TGW6載體秈稻S95B突變體植株千粒重表型鑒定顯示較對照變化不大，只有1株千粒重22.78g大于對照7.09%，其它均低于對照組。轉pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1載體S95B和H447，堊白性狀鑒定結果表明，其堊白度基本表現(xiàn)為高于對照組，H447陽性株系堊白度最高達到19.44%，明顯高

7、于堊白度1.96%的對照組，S95B陽性株系堊白度最高達到28.91%，明顯高于堊白度2.80%的對照組。轉pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-2載體02428突變植株，堊白度性狀基本表現(xiàn)為低于對照組，陽性株系堊白度最低達到61.29%，明顯低于堊白度84.00%對照組。
　　（5）初步建立了一整套基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點編輯水稻基因的技術體系，規(guī)范和完善了水稻突變體基因鑒定和表型鑒定技術流程，初步建立了基于C