1、油菜菌核?。⊿clerotinia stem rot）是由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.） de Bary）引起的一種危害油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的世界性真菌病害。目前對(duì)于此類病害的研究主要集中在病原菌的分離和鑒定、抗病資源的篩選、抗病育種以及QTL（Quantitative trait loci）定位等方面，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上研究甘藍(lán)型油菜菌核病的抗病響應(yīng)分子機(jī)制還較少。microRNAs（miRNAs）是

2、一種內(nèi)源性的單鏈非編碼小分子RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平通過負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)或抑制靶mRNA的翻譯來參與調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等。迄今為止在miRBase2.10數(shù)據(jù)庫中僅有92條油菜miRNAs的信息，遠(yuǎn)少于同屬十字花科的擬南芥。本實(shí)驗(yàn)從以下兩個(gè)方面來鑒定甘藍(lán)型油菜菌核病抗性相關(guān)的miRNAs和基因，通過對(duì)差異miRNAs的表達(dá)模式及其基因的功能進(jìn)行分析來探尋其在油菜抗菌核病過程的作用機(jī)理，初步揭示甘藍(lán)型油菜和菌核病互作的復(fù)雜機(jī)

3、制，為油菜菌核病抗病育種和抗病關(guān)鍵基因的克隆和研究提供理論依據(jù)。
　　1、對(duì)未接種核盤菌（0h）以及接種后48h的甘藍(lán)型油菜抗病種質(zhì)資源莖稈進(jìn)行miRNA、轉(zhuǎn)錄組和降解組測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)分析挖掘甘藍(lán)型油菜菌核病抗性相關(guān)miRNAs和基因，探究這些miRNAs和基因在甘藍(lán)型油菜應(yīng)答菌核病脅迫中的功能，主要結(jié)果如下：
　　（1）miRNA測(cè)序共鑒定出77個(gè)已知miRNAs，它們分別屬于30個(gè)miRNA家族，其中CK-0h和T

4、-48h文庫中各有76和68個(gè)；共獲得176個(gè)新miRNAs，其中novel_miR_74僅存在CK-0h中，其余新miRNAs均存在于兩文庫中；51個(gè)差異表達(dá)miRNAs共預(yù)測(cè)到122個(gè)靶基因，結(jié)合GO（Gene Ontology）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）和 KEGG（ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能注釋以及轉(zhuǎn)錄

5、組測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的一些甘藍(lán)型油菜miRNAs的靶基因，如bna-miR156a/156f調(diào)控的靶基因與SPL轉(zhuǎn)錄因子和NPH3家族蛋白相關(guān)，bna-miR166f調(diào)控的靶基因與REVOLUTA相關(guān)，novel_miR_173調(diào)控的靶基因與TIR-NBS-LRR抗病蛋白相關(guān)，novel_miR_2和novel_miR_73調(diào)控的靶基因與類受體蛋白相關(guān)，推測(cè)這些miRNAs及其靶基因可能參與甘藍(lán)型油菜菌核病的響應(yīng)過程。
　?。?）

6、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共檢測(cè)到7,371個(gè)差異表達(dá)基因（上調(diào)2,215、下調(diào)5,156）；將其與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php）進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)有602個(gè)差異基因（上調(diào)168、下調(diào)434）分別屬于39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族；而與擬南芥激素?cái)?shù)據(jù)庫（http://ahd.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)有685個(gè)基因（上調(diào)216、下調(diào)469）分別屬于8種植物激素類別；與GO、C

7、OG和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，篩選出1,570個(gè)候選的甘藍(lán)型油菜菌核病抗性相關(guān)基因，包括339個(gè)蛋白激酶相關(guān)基因、118個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、43個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、113個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因、65個(gè)抗病基因、187個(gè)激素相關(guān)基因、141個(gè)次生代謝相關(guān)基因、592個(gè)其它功能相關(guān)基因。
　?。?）降解組測(cè)序共檢測(cè)到80處降解位點(diǎn)，即80個(gè)靶基因與41個(gè)已知miRNAs和23個(gè)新miRNAs相對(duì)應(yīng)。功能分析結(jié)果顯示，靶基因的切割方式分為Category0和1

8、類，其中大多已知miRNAs靶向SBP、ARF、NAC、TOE等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；部分新miRNAs的靶基因是DCL1、TCP和MYB轉(zhuǎn)錄因子以及抗病蛋白家族基因。
　?。?）篩選出的部分差異表達(dá) miRNAs及其靶基因的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative Real-time PCR, qRT-PCR）結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜miRNAs負(fù)調(diào)控其靶基因，且候選的抗病相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。
　

9、　2、以未接菌（0h）以及接菌24h、48h后的甘藍(lán)型油菜抗病和感病種質(zhì)資源莖稈為樣本，構(gòu)建6個(gè)小RNA文庫，通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析篩選差異表達(dá)miRNAs及其靶基因并對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，初步探討差異表達(dá)miRNAs及其靶基因在不同抗病力的甘藍(lán)型油菜菌核病響應(yīng)過程中的調(diào)控機(jī)制，主要結(jié)果如下：
　?。?）共獲得71已知miRNAs，它們分別屬于28個(gè)miRNA家族，其中除bna-miR6034僅在抗病材料接菌24h后

10、檢測(cè)到外，其它的已知miRNAs在第二章miRNA測(cè)序中同樣被檢測(cè)到，且其表達(dá)豐度大致相同；1,402個(gè)新miRNAs中部分miRNAs與已知miRNA家族成員的序列保守性較高，推測(cè)其可能是這些miRNA家族的新成員。
　?。?）通過對(duì)接菌前后抗病或感病材料中miRNAs的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在抗病和感病材料中分別有569個(gè)和680個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，且隨著脅迫時(shí)間的延長數(shù)量有所增加。在接菌24h的抗病甘藍(lán)型油菜中差異表達(dá)

11、的miRNAs數(shù)量較感病材料要多，而接菌48h又比感病材料略低，表明抗病材料相對(duì)于感病材料響應(yīng)菌核病侵染更迅速；與0h相比，菌核病脅迫48h后在抗病材料中獲得的bna-miR156和bna-miR166f在第二章結(jié)果中同樣差異表達(dá)，但差異表達(dá)倍數(shù)較前文鑒定結(jié)果略高。
　?。?）通過對(duì)接菌前后抗病和感病材料間miRNAs的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)過程。
　?。?）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共檢測(cè)到7,371個(gè)差異表達(dá)基因（上調(diào)2,215、下

12、調(diào)5,156）；將其與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php）進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)有602個(gè)差異基因（上調(diào)168、下調(diào)434）分別屬于39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族；而與擬南芥激素?cái)?shù)據(jù)庫（http://ahd.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)有685個(gè)基因（上調(diào)216、下調(diào)469）分別屬于8種植物激素類別；與GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，篩選出1,570個(gè)候選的甘藍(lán)型油

13、菜菌核病抗性相關(guān)基因，包括339個(gè)蛋白激酶相關(guān)基因、118個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、43個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、113個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因、65個(gè)抗病基因、187個(gè)激素相關(guān)基因、141個(gè)次生代謝相關(guān)基因、592個(gè)其它功能相關(guān)基因。
　　（3）降解組測(cè)序共檢測(cè)到80處降解位點(diǎn)，即80個(gè)靶基因與41個(gè)已知miRNAs和23個(gè)新miRNAs相對(duì)應(yīng)。功能分析結(jié)果顯示，靶基因的切割方式分為Category0和1類，其中大多已知miRNAs靶向SBP、ARF、NAC、TOE

14、等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；部分新miRNAs的靶基因是DCL1、TCP和MYB轉(zhuǎn)錄因子以及抗病蛋白家族基因。
　?。?）篩選出的部分差異表達(dá) miRNAs及其靶基因的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative Real-time PCR, qRT-PCR）結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜miRNAs負(fù)調(diào)控其靶基因，且候選的抗病相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。
　　2、以未接菌（0h）以及接菌24h、48h后的甘藍(lán)型油菜抗病

15、和感病種質(zhì)資源莖稈為樣本，構(gòu)建6個(gè)小RNA文庫，通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析篩選差異表達(dá)miRNAs及其靶基因并對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，初步探討差異表達(dá)miRNAs及其靶基因在不同抗病力的甘藍(lán)型油菜菌核病響應(yīng)過程中的調(diào)控機(jī)制，主要結(jié)果如下：
　?。?）共獲得71已知miRNAs，它們分別屬于28個(gè)miRNA家族，其中除bna-miR6034僅在抗病材料接菌24h后檢測(cè)到外，其它的已知miRNAs在第二章miRNA測(cè)序中同樣被

16、檢測(cè)到，且其表達(dá)豐度大致相同；1,402個(gè)新miRNAs中部分miRNAs與已知miRNA家族成員的序列保守性較高，推測(cè)其可能是這些miRNA家族的新成員。
　?。?）通過對(duì)接菌前后抗病或感病材料中miRNAs的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在抗病和感病材料中分別有569個(gè)和680個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，且隨著脅迫時(shí)間的延長數(shù)量有所增加。在接菌24h的抗病甘藍(lán)型油菜中差異表達(dá)的miRNAs數(shù)量較感病材料要多，而接菌48h又比感病材料略低

17、，表明抗病材料相對(duì)于感病材料響應(yīng)菌核病侵染更迅速；與0h相比，菌核病脅迫48h后在抗病材料中獲得的bna-miR156和bna-miR166f在第二章結(jié)果中同樣差異表達(dá)，但差異表達(dá)倍數(shù)較前文鑒定結(jié)果略高。
　?。?）通過對(duì)接菌前后抗病和感病材料間miRNAs的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在未接菌的材料間有29個(gè)特異表達(dá)的miRNAs，在接菌后的材料間有55個(gè)特異表達(dá)的miRNAs，并發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)的已知miRNAs（如，bna-miR16

18、7a、bna-miR167b、bna-miR167c、bna-miR167d和bna-miR403）均在接菌后的抗病材料中較早表達(dá)。
　?。?）靶基因預(yù)測(cè)和功能注釋結(jié)果表明，941個(gè)差異表達(dá)miRNAs所調(diào)控的5,667個(gè)靶基因，主要涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝、脅迫響應(yīng)、氧化爆發(fā)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑，其中一些甘藍(lán)型油菜miRNAs的靶基因，如bna-miR172、bna-miR403和novel_mir_376的靶基因

19、與TIR-NBS-LRR抗病蛋白相關(guān)，bna-miR164和 bna-miR390調(diào)控的靶基因與富含亮氨酸受體蛋白激酶家族蛋白相關(guān)， bna-miR393的靶基因是生長素受體、bna-miR160和bna-miR167的靶基因是生長素響應(yīng)因子，bna-miR168a的靶基因是AGO1蛋白和ZLL等，推測(cè)這些miRNA及其靶基因可能與甘藍(lán)型油菜的菌核病抗性相關(guān)。
　?。?）結(jié)合Pathway分析，共獲得了295條代謝途徑，分析結(jié)果表

20、明油菜在逆境脅迫下會(huì)通過miRNAs調(diào)節(jié)代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)來提高自身的抗病能力，如bna-miR164a/b/c/d、bna-miR172a/d、bna-miR390a/b/c、bna-miR396a、bna-miR403參與植物和病原菌互作過程，bna-miR172a/d參與次生代謝過程，bna-miR164a/b/c/d bna-miR390a/b/c、bna-miR393、bna-miR394a/b和bna-miR6028參

21、與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等，進(jìn)一步證明植物的抗病機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，它涉及到多個(gè)代謝途徑的相互協(xié)作。
　　（6）對(duì)6個(gè)候選miRNAs的表達(dá)情況進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合第二章miRNA和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其在菌核病脅迫下的抗病和感病材料中的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果基本一致，其中在接菌后24h的抗病材料中有3個(gè)miRNAs的相對(duì)表達(dá)量高于感病材料，而在接菌后48h有5個(gè)miRNAs的相對(duì)表達(dá)量高于感病材料；相應(yīng)靶基因