1、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）是我國(guó)重要的油料作物，而菌核病(Sclertiniasclerotiorum(Lib.) de Bary)是油菜生產(chǎn)最主要的限制因子，嚴(yán)重威脅著我國(guó)的油菜生產(chǎn)。目前，人們關(guān)于B.napus對(duì)S.sclerotiorum的抗病機(jī)制仍不甚了解。在對(duì)各種寄主和病原菌相互作用的研究中已經(jīng)顯示，植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子在寄主抗病性中起著重要作用，然而，對(duì)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子在B.napus與S.scleroti

2、orum互作中的抗病機(jī)制仍沒有研究或未見報(bào)道。
　　本研究從B.napus中克隆了一個(gè)編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因BnWRKY33，序列分析顯示，其編碼蛋白BnWRKY33含有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和5個(gè)MAPK激酶磷酸化位點(diǎn)，且有一個(gè)在與VQ蛋白相互作用中起關(guān)鍵作用的天冬氨酸殘基。誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，油菜被菌核病侵染后Bn WRKY33迅速上調(diào)表達(dá)，茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)誘導(dǎo)時(shí)Bn WRK Y33也有不同程度地響應(yīng)表達(dá)。結(jié)果表明

3、，Bn WRKY33是菌核病侵染的響應(yīng)基因。
　　為了進(jìn)一步研究Bn WRKY33的抗菌核病功能，本研究構(gòu)建了BnWRKY33植物表達(dá)載體1300-35S-WRKY33-NOS，使用In planta Agrobacterium-mediated方法轉(zhuǎn)化油菜，并經(jīng)潮霉素篩選和PCR檢測(cè)，鑒定獲得17個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。本研究選擇了經(jīng)RT-PCR表達(dá)分析鑒定出的3個(gè)獨(dú)立的Bn WRKY33過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系用作后續(xù)分析。
　　抗

4、病鑒定實(shí)驗(yàn)顯示Bn WRKY33過表達(dá)油菜轉(zhuǎn)基因植株對(duì)菌核病的抗性顯著增強(qiáng)。qRT-PCR表達(dá)分析顯示，當(dāng)BnWRKY33高表達(dá)時(shí)，茉莉酸防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)志基因BnPDF1.2和水楊酸防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)志基因BnPR1顯著上調(diào)表達(dá);DAB組織染色實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)S.sclerotiorum侵染時(shí)，Bn WRKY33的過量表達(dá)顯著抑制H2O2的積累。進(jìn)而，我們從B.napus中分離了一個(gè)MAPK激酶底物基因BnMKS1，發(fā)現(xiàn)BnMKS1具有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和

5、10個(gè)MAPK激酶磷酸化位點(diǎn)，在第二個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域中，含有1個(gè)較短的FxxxVQxLTG VQ蛋白基序，表明BnMKS1屬于VQ蛋白家族。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明，BnMKS1能夠與BnMPK4和BnWRKY33直接相互作用，而BnMPK4和BnWRKY33不能直接相互作用。在煙草葉片和油菜子葉中的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)均顯示這三個(gè)蛋白都定位于細(xì)胞核。同時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示它們對(duì)菌核病侵染表現(xiàn)為協(xié)同應(yīng)答。
　　本研究表明，Bn WRKY33在