1、目的：糖尿病心肌病是糖尿病主要的心血管病變之一，心肌細胞肥大是其主要的病理變化之一，它在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。G-蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5（Gprotein-coupled bile acid receptor5,TGR5）是一種新型的膽汁酸膜受體，在炎癥、糖脂代謝、能量代謝等方面起重要作用。本實驗采用高糖誘導(dǎo)乳小鼠心肌細胞肥大，探討激活TGR5對心肌細胞肥大的影響以及TGR5是否通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineuri

2、n,CaN)/活化T細胞核因子3（nuclear factor of activated T cells3,NFAT3）信號通路起作用，為以TGR5為靶點的糖尿病心臟并發(fā)癥的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.原代乳小鼠心肌細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定采用兩步法分離消化細胞，聯(lián)合差速貼壁法（貼壁時間約70min）+化學試劑抑制法（在培養(yǎng)基中加5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5- bromodeoxyuridine,BrdU)來純化心肌細

3、胞，通過普通光學顯微鏡及免疫熒光染色法進行心肌細胞鑒定。
　　2.摸索高糖誘導(dǎo)心肌細胞肥大的最佳條件根據(jù)葡萄糖的不同濃度分為5組：正常對照組（Control5.5mmol/L葡萄糖）、低糖高滲組（HT5.5mmol/L葡萄糖+27.5mmol/L甘露醇），高糖組A（HG A,25mmol/L葡萄糖），高糖組B(HG B,33mmol/L葡萄糖),高糖組C(HG C,44mmol/L葡萄糖)作用時間24h，找出最適葡萄糖濃度范圍。以

4、最適的葡萄糖濃度（33mmol/L葡萄糖）再設(shè)置不同時間觀察點，分為4組：正常對照組(Control)、高糖刺激24h組(HG24h)、高糖刺激48h組(HG48h)、高糖刺激72h組(HG72h)，找到最適時間范圍。分別檢測各個實驗組心肌細胞表面積、蛋白總含量以及肥大相關(guān)基因心房利鈉肽（atrial natriuretic polypeptide,ANP）、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)的表達

5、量。
　　3.有效TGR5腺病毒感染的篩選吸取細胞懸液100uL(濃度約為1×105個/mL)接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)48h，選取狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)實驗。根據(jù)是否加細胞感染增強液polybrene分為3組：空白組、病毒組、病毒+polybrene組；采用1/2體積感染法，感染心肌細胞72h后，通過熒光顯微鏡觀察紅色熒光的表達情況。
　　4.檢測TGR5在乳小鼠心肌細胞的表達情況通過腺病毒感染乳小鼠心肌細胞沉默TGR5的

6、表達，測定其TGR5 mRNA及蛋白表達量。
　　5.探究激活TGR5對高糖誘導(dǎo)心肌細胞肥大的影響及可能的作用機本實驗采用 TGR5腺病毒(TGR5shRNA)、TGR5特異性激動劑6a-ethyl-23(S)-甲基膽汁酸(6a-ethyl-23(S)-methyl-cholicacid,S-EMCA,INT-777)以及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素（cyclosporine A,CsA）處理心肌細胞；分為5組：正常對照組(Cont

7、rol)、高糖組(HG)、高糖+INT-777組(HG+INT-777)、高糖+CsA組(HG+CsA)、高糖+INT-777+TGR5 shRNA組(HG+INT-777+TGR5shRNA)。分別檢測各個實驗組心肌細胞表面積、蛋白總含量、肥大相關(guān)基因ANP、β-MHC的表達量，CaN及核NFAT3 mRNA、蛋白表達量。
　　結(jié)果：
　　1.通過臺盼藍染色普通光學顯微鏡檢及免疫熒光染色法，原代培養(yǎng)的細胞通過鑒定是心肌細胞

8、，存活率可達到98％以上，純度可達到95%以上。
　　2.與正常對照組相比，25mmol/L、33mmol/L、44mmol/L的高糖組心肌細胞表面積均增大、蛋白總含量均增加（P＜0.05），ANP、β-MHC mRNA的表達量均增加（P＜0.05）；而相較于正常對照組，低糖高滲組細胞表面積、蛋白總含量以及ANP、β-MHC mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。根據(jù)上述實驗結(jié)論，予以葡萄糖濃度為33mmol/L的培養(yǎng)

9、基培養(yǎng)心肌細胞，設(shè)置三個不同時間點，高糖刺激24h、48h、72h組均出現(xiàn)不同程度的細胞表面積增大、蛋白總含量增加（P＜0.05），ANP、β-MHC mRNA的表達量增加（P＜0.05）；其中以高糖刺激48h組細胞表面積、蛋白總含量及ANP、β-MHC mRNA的表達量最高。
　　3.在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光的表達，表明TGR5腺病毒成功感染心肌細胞；病毒+polybrene組感染心肌細胞的效果明顯優(yōu)于病毒組，以感染復(fù)數(shù)(m

10、ultiplicity of infection,MOI)等于100作為感染條件，感染效率可達到90%以上。
　　4.高糖使心肌細胞表面積明顯增大（P＜0.01）、蛋白總含量顯著增加（P＜0.01）以及CaN、核NFAT3的表達量顯著增加（P＜0.05）；INT-777能夠抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細胞肥大、下調(diào)CaN的表達（P＜0.05）；INT-777或CsA均可下調(diào)核NFAT3的表達量（P＜0.05）；通過腺病毒感染心肌細胞沉默TG