1、虎紋捕鳥(niǎo)蛛(Haplopelma schmidti)、敬釗纓毛蛛(Chilobrachysguangxiensis)、海南捕鳥(niǎo)蛛(Haplopelma hainanum)都分布于我國(guó)南方地區(qū)，屬于體型較大、毒性較強(qiáng)且稀有的捕鳥(niǎo)蛛。在本實(shí)驗(yàn)室以前的工作中，分別從它們的粗毒中分離到了虎紋毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)、虎紋毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)、海南毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)、敬釗毒素-Ⅲ(JZTX-Ⅲ)，并通過(guò)電生理實(shí)驗(yàn)了解這四種毒素對(duì)于電壓敏

2、感鈉通道(VGSCs)具有不同的選擇性及作用強(qiáng)度，但是具體相互作用機(jī)制仍然不清楚。本文試圖利用酵母雙雜交技術(shù)來(lái)部分解決這個(gè)問(wèn)題。將編碼毒素成熟肽的基因序列連入pGBKT7(酵母雙雜交載體)，將編碼電壓敏感鈉通道膜外區(qū)的基因序列連入另一載體pGADT7。通過(guò)酵母雙雜交的手段，分別檢測(cè)到了以上四種毒素對(duì)hNav1.7、hNav1.5通道膜外區(qū)潛在的相互作用位點(diǎn)。HWTX-Ⅳ和hNav1.7的潛在的作用位點(diǎn)僅為通道結(jié)構(gòu)域Ⅲ的S3-S4胞外連接

3、片段(DⅢ-S3-S4)。HWTX-Ⅰ與hNav1.7的潛在的作用位點(diǎn)為DⅠ-S3-S4、DⅢ-S1-S2、DⅢ-S5-S6、DⅣ-S5-S6。HNTX-Ⅳ和hNav1.7的潛在的作用位點(diǎn)是DⅠ-S3-S4、DⅡ-S1-S2、DⅢ-S1-S2、DⅢ-S5-S6。JZTX-Ⅲ和hNav1.7的潛在的作用位點(diǎn)是DⅠ-S3-S4、DⅠ-S5-S6、DⅡ-S1-S2、DⅢ-S5-S6、DⅣ-S1-S2、DⅣ-S5-S6。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)JZTX

4、-Ⅲ與hNav1.5的潛在的作用位點(diǎn)是DⅠ-S1-S2、DⅡ-S3-S4，DⅢ-S3-S4。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室以前的工作中，已經(jīng)在膜片鉗上檢測(cè)了天然HWTX-Ⅳ對(duì)hNav1.7通道電流的抑制作用，其半數(shù)抑制量(IC50)為26 nM；JZTX-Ⅲ對(duì)bNav1.5有抑制作用，其IC50大約在300 nM附近(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本文中我們又在膜片鉗上檢測(cè)了天然的HWTX-Ⅰ，HNTX-Ⅳ，JZTX-Ⅲ對(duì)于hNav1.7通道電流的抑制能力

5、。其中毒素HWTX-Ⅰ，HNTX-Ⅳ對(duì)于hNav1.7通道電流的IC50分別為640 nM和22 nM。JZTX-Ⅲ在1μM濃度時(shí)，對(duì)hNav1.7通道電流沒(méi)有明顯抑制能力。這四個(gè)毒素對(duì)hNav1.7通道電流的抑制能力依次是：HNTX-Ⅳ≈HWTX-Ⅳ>HWTX-Ⅰ>>JZTX-Ⅲ。
　　 通過(guò)綜合分析酵母顯色和電生理的結(jié)果我們可以得出：1)HNTX-Ⅳ和HWTX-Ⅳ對(duì)hNav1.7通道的S5-S6這些膜外區(qū)中的大部分并沒(méi)有相互

6、作用；2)雖然電生理的結(jié)果，HNTX-Ⅳ和HWTX-Ⅳ對(duì)hNav1.7電流的抑制能力十分接近，但是通過(guò)分析酵母相互作用的結(jié)果，兩者的作用位點(diǎn)卻差異明顯。其中HWTX-Ⅳ能夠檢測(cè)到的作用位點(diǎn)僅有一個(gè)，而HNTX-Ⅳ有4處；3)通過(guò)分析酵母顯色結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)通道hNav1.5與hNav1.7之間，很可能是由于DⅡ-S3-S4和DⅢ-S3-S4這兩部分膜外區(qū)的差別，導(dǎo)致對(duì)JZTX-Ⅲ敏感性的不一樣。
　　 雖然VGSCs在S1-S2、

7、S3-S4膜外區(qū)的氨基酸在10個(gè)附近，但是在我們參看相關(guān)文獻(xiàn)后，預(yù)測(cè)其核心序列在6個(gè)氨基酸左右，我們直接在酵母雙雜交載體pGADT7的多克隆位點(diǎn)上插入編碼隨機(jī)的六個(gè)氨基酸的序列，從而組成一個(gè)隨機(jī)六肽文庫(kù)。我們通過(guò)2種方式構(gòu)建了能夠用于酵母雙雜交的隨機(jī)六肽文庫(kù)。第一種方法是常規(guī)的，需要依賴酶切和連接的方式；而第二種方法是直接通過(guò)PCR來(lái)完成文庫(kù)質(zhì)粒構(gòu)建的全新方法。兩種方法均能得到庫(kù)容量在10萬(wàn)左右的高質(zhì)量隨機(jī)六肽文庫(kù)。隨后對(duì)兩種方法所得的

8、文庫(kù)，隨機(jī)挑選20個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：兩個(gè)文庫(kù)都有70％的序列是符合設(shè)計(jì)初衷的編碼隨機(jī)六肽的序列，并且沒(méi)有一個(gè)重復(fù)序列，代表兩個(gè)文庫(kù)里面的復(fù)雜度良好。
　　 本文的另一個(gè)工作是建立了一種表達(dá)小分子生物活性多肽的方法。我們分別將編碼虎紋毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)，海南毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)，敬釗毒素-Ⅴ(JZTX-Ⅴ)的序列通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)手段獲得，然后分別連接入表達(dá)載體pET-40b，接著轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL2

9、1(DE3)，最后以乳糖為誘導(dǎo)物，來(lái)實(shí)現(xiàn)目的蛋白在大腸桿菌周質(zhì)空間的融合表達(dá)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，均能檢測(cè)到三種毒素以融合蛋白的形式表達(dá)。進(jìn)一步將部分可溶的虎紋毒素-Ⅰ融合蛋白(帶組氨酸標(biāo)簽)用鎳柱純化。純化后的產(chǎn)物通過(guò)透析、除鹽后，再加入腸激酶消化來(lái)釋放重組的虎紋毒素-Ⅰ(rHWTX-Ⅰ)，接著通過(guò)反相高效液相色譜法(RP-HPLC)來(lái)純化rHWTX-Ⅰ。經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，rHWTX-Ⅰ的分子量和天然HWTX-Ⅰ一樣，都為3750.6