1、目的：
　　杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是肌營養(yǎng)不良性肌病中最嚴重的一種，是一種 X連鎖隱形遺傳病，發(fā)病率最高，約為1/3500男嬰。主要為編碼 dystrophin蛋白的基因發(fā)生突變， dys trop hin蛋白生成缺陷，致使細胞膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在外部機械力的作用下極易發(fā)生損傷，導(dǎo)致肌細胞壞死，伴隨炎癥細胞的浸潤吞噬壞死細胞過程，而肌肉本身的再生修復(fù)能力不足以彌補其壞死的程度

2、，纖維結(jié)締組織和脂肪組織便隨后替代壞死的區(qū)域。DMD的病人肌肉損傷持續(xù)性進展，無力逐漸加重，通常于20歲左右死于呼吸、循環(huán)衰竭。對于此病，目前尚無有效的治療辦法。
　　Mdx小鼠是研究DMD的一種經(jīng)典的模型鼠。此種小鼠表現(xiàn)為高CK血癥及和人類肌營養(yǎng)不良相似的肌肉病理情況。
　　對于mdx小鼠的治療，有各種各樣的方法。目前，利用載體將正常的dys trop hin基因?qū)肷矬w內(nèi)或修復(fù)其突變成為一大熱點，但dys trop h

3、in基因過于龐大，成為這一方法的一大阻礙。近年來，很多人將目光放在肌營養(yǎng)不良肌病的各種癥狀上，利用各種生長因子，通過不同的信號途徑促進肌細胞的再生，從而改善肌病的狀況。
　　胰島素樣生長因子-1（Insulin like growth factor-1, IGF-1）已成為治療DMD的一個重要備選方向。IGF-1也被稱作"促生長因子"（即somatomedin C），是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白物質(zhì)。 IGF-1在嬰兒

4、的生長和在成人體內(nèi)持續(xù)進行合成代謝作用上具有重要意義。它是人體內(nèi)肝細胞、腎細胞、脾細胞等十幾種細胞自分泌和旁分泌的產(chǎn)物。具有降血糖、降血脂、舒張血管等作用，同時還是人體內(nèi)非常重要的細胞有絲分裂促進劑，其對維持與細胞分化有關(guān)的蛋白質(zhì)水平十分重要，與一些生長因子合用能促進細胞分化成熟。
　　目前關(guān)于IGF-1對于md x小鼠的研究，主要為兩方面：一是mdx/mIGF-1轉(zhuǎn)基因小鼠的觀察，另一個是IGF-1蛋白對mdx小鼠的作用的研究。

5、兩種方法雖然均有效果，但第一種不適宜向臨床推廣，第二種在蛋白入血后有較多副作用，且需長期持續(xù)給藥，操作費時費力。在本實驗中，我們以腺相關(guān)病毒血清型9（Adeno-associated virus serotype9, AAV9）為載體攜帶人胰島素樣生長因子-1（human ins ulin like gro wt h fac to r-1, hIGF-1）hIGF-1基因，首先局部注射入脛前肌，觀察此種方法的具體作用，其次經(jīng)尾靜脈注射入

6、小鼠全身，觀察是否可在全身的骨骼肌中發(fā)揮作用。
　　方法：
　　我們的實驗分為兩個階段：首先是局部注射的方法，將病毒直接注射入小鼠右側(cè)脛前肌，一定時間后觀察；其次是通過尾靜脈注射入病毒，一定時間后觀察。
　　1通過局部注射的方法觀察以AAV9為載體攜帶hIGF-1基因是否對mdx小鼠肌肉產(chǎn)生作用
　　選取4周齡、體重相近的雄性mdx小鼠8只，分為2組。4只于右側(cè)脛前肌注射 AAV9攜帶的綠色熒光蛋白（Green

7、Fluorescence Protein, GFP）基因（20μl/只1×1012 vg/mL），分2點注射，每點約注射10μl，4只于右側(cè)脛前肌注射AAV9- hIGF-1（20μl/只1×1012 vg/mL），同樣分2點注射，每點約注射10μl。另選取4只4周齡、體重相近的雄性C57 BL/10小鼠作為對照。8周后（即小鼠12周齡時）將小鼠麻醉后在右側(cè)脛前肌進行肌力測試，隨后摘眼球取血，留取血清樣本測CK值，最后完整分離右側(cè)脛前肌

8、稱重，并包埋，進行冰凍切片的處理，以及各種指標的檢測。
　　2通過尾靜脈注射的方法觀察以AAV9為載體攜帶hIGF-1基因是否對mdx小鼠全身骨骼肌產(chǎn)生作用
　　選取6周齡、體重相近的雄性mdx小鼠6只，分為2組。3只經(jīng)尾靜脈注射 AAV9-GFP（200μl/只1×1012 vg/ml），3只經(jīng)尾靜脈注射 AAV9-hIGF-1（20μl/只1×1012 vg/ml）。另選取3只4周齡、體重相近的雄性C57BL/10小鼠3

9、只作為對照。6周后（即小鼠12周齡時）將9只小鼠麻醉后取材，進行同樣的評估。另同時分離兩側(cè)股四頭肌、腓腸肌、肱三頭肌，右側(cè)所有肌肉包埋，進行冰凍切片的處理，隨后進行各種指標的檢測。
　　應(yīng)用s p s s13.0系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行分析。
　　結(jié)果：
　　1局部脛前肌注射 AAV9介導(dǎo)hIGF-1基因過表達改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能
　　1.1 mdx小鼠經(jīng)局部脛前肌注射AAV9-GFP后，觀察到其肌肉組織中

10、有綠色熒光蛋白的表達。驗證了在本實驗室條件下AAV9可以成功的轉(zhuǎn)染肌細胞并表達所攜帶的基因；
　　1.2免疫熒光結(jié)果表明與C57BL/10組、GFP組相比，只有hIGF-1組小鼠脛前肌中表達hIGF-1；
　　1.3 hIGF-1組、GFP組、C57BL/10組右側(cè)脛前肌重量比較，hIGF-1組最大，為80.70±8.00mg, GFP組為58.35±4.26mg，C57BL/10組為39.93±0.81m g。各組之間差異

11、均有統(tǒng)計學意義。因發(fā)現(xiàn)G FP組較C57BL/10組大，為驗證md x小鼠同C57BL/10肌重的區(qū)別，我們又增加一組未給任何干預(yù)的mdx小鼠，測其肌重，為60.20±2.75mg，與GFP組相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　1.4 hIGF-1組、GFP組、C57BL/10組肌肉損傷程度定量比較
　　1.4.1血清CK水平：野生型小鼠血清CK水平為5076.67±3959.18U/L， AAV9-GFP mdx小鼠CK值為263

12、45.64±5762.39 U/L，AAV9-hIGF-1 mdx小鼠CK值為39446.28±15905.25 U/L。mdx小鼠較正常野生型小鼠CK值均升高，但GFP組和hIGF-1組之間無明顯差別；
　　1.4.2肌肉病理：蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin, HE）染色中，GFP組小鼠脛前肌壞死面積較大，所占比例為6.33±2.51％， hIGF-1組小鼠脛前肌壞死面積相比GFP組有所減少，所占比例為2.14

13、±0.43%，差異具有統(tǒng)計學意義；而兩組再生肌纖維數(shù)目占總纖維數(shù)的百分比無明顯差異；1.4.3肌力：hIGF-1組小鼠脛前肌的肌力最大，其次為GFP組，野生型小鼠肌力最小；而脛前肌的耐力測試，結(jié)果正好相反。
　　2尾靜脈注射 AAV9介導(dǎo)hIGF-1基因過表達改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能
　　2.1 mdx小鼠經(jīng)尾靜脈注射AAV9-GFP后，觀察到只有脛前肌表達較多量綠色熒光蛋白，其余肌肉表達量很少；
　　2.

14、2免疫熒光結(jié)果表明與C57BL/10組、GFP組相比，只有hIGF-1組小鼠脛前肌中表達hIGF-1，因小鼠本身并不產(chǎn)生此種蛋白；
　　2.3 hIGF-1組、GFP組、C57BL/10組右側(cè)脛前肌重量比較，hIGF-1組最大，為75.03±4.54mg, GFP組為55.63±13.34mg，C57BL/10組為40.07±0.93mg。各組之間差異均有統(tǒng)計學意義。
　　2.4 hIGF-1組、GFP組、C57BL/10組

15、肌肉損傷程度定量比較
　　2.4.1血清CK水平：AAV9-GFP mdx小鼠CK值為33418.57±11695.54 U/L，AAV9-hIGF-1 mdx小鼠CK值為31855.8±16394.13 U/L。mdx小鼠較正常野生型小鼠CK值均升高，但GFP組和hIGF-1組之間無明顯差別；2.4.2肌肉病理：HE染色中，AAV9-GFP mdx小鼠脛前肌壞死面積所占比例為6.34±2.51%，AAV9-hIGF-1 mdx小

16、鼠脛前肌壞死面積所占比例為2.46±0.54%，較之明顯減少；而中心核細胞所占比例，經(jīng)計數(shù)，無統(tǒng)計學意義；
　　2.4.3肌力：hIGF-1組小鼠脛前肌的肌力均大于對照組、GFP組；hIGF-1組小鼠脛前肌的耐力測試，小于C57BL/10組，大于G FP組。
　　結(jié)論：
　　1 AAV9攜帶的hIGF-1基因可在小鼠骨骼肌中成功表達；
　　2 AAV9攜帶的hIGF-1基因在體內(nèi)表達在病理上可促進mdx小鼠骨骼肌