1、研究目的:
　　自新西蘭大白兔股骨穿刺抽取兔骨髓液，貼壁法分離培養(yǎng)出兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，用流式細(xì)胞儀對兔BMSCs表面的陽性標(biāo)記物和陰性標(biāo)記物進(jìn)行檢測予以確定所得種子細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞;并對目標(biāo)種子細(xì)胞的分化能力進(jìn)行成骨、成軟骨及成脂能力進(jìn)行檢測，以確定目標(biāo)種子細(xì)胞的增殖分化能力。構(gòu)建TGF-β1、Sox-9基因序列并鑒定其正確性，以pLVX-IRES-Puro為穿梭載體，構(gòu)建TGF-β1(pLVX-TGF-β1)和So

2、x-9(pLVX-Sox-9)載體，以確定轉(zhuǎn)染的可行性。聯(lián)合TGF-β1、Sox-9共轉(zhuǎn)染兔BMSCs，進(jìn)行目的基因與下游基因的檢測，以確定轉(zhuǎn)染后新型干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的可行性與優(yōu)勢。以Courtman脫細(xì)胞法對豬纖維環(huán)進(jìn)行脫細(xì)胞處理得到脫細(xì)胞纖維環(huán)支架，并進(jìn)行脫細(xì)胞效果檢測，行脫細(xì)胞支架與共轉(zhuǎn)染干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程纖維環(huán)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　研究方法:
　　骨穿獲取兔骨髓液后行貼壁培養(yǎng)后分離培養(yǎng)出兔BMSCs，利用流式細(xì)胞術(shù)

3、對細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD31、CD44、CD45、CD90進(jìn)行檢測以確定其為本研究所需要的目標(biāo)種子細(xì)胞。人工合成Sox-9、TGF-β1基因片段，并行其基因序列檢測確定其正確性。
　　以全骨髓貼壁法對獲取的新西蘭大白兔骨髓進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)處理，分離出兔BMSCs，通過兔BMSCs表面抗原檢測來鑒定所分離培養(yǎng)的BMSCs的真實(shí)可靠性。人工合成Sox-9和TGF-β1基因片段，通過基因測序的方法來確定構(gòu)建的基因序列。以pLVX-IR

4、ES-Puro為穿梭載體，構(gòu)建TGF-β1慢病毒(pLVX-TGF-β1)和(pLVX-Sox-9)，通過Real-time PCR對已構(gòu)建的TGF-β1、Sox-9慢病毒進(jìn)行檢測，根據(jù)TGF-β1、Sox-9mRNA的表達(dá)情況來初步推斷是否轉(zhuǎn)染成功。將已成功獲取并已鑒定的兔BMSCs傳代培養(yǎng)后，分為:A.空載體組;B.TGF-β1基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染組;C.Sox-9基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染組;D.TGF-β1和Sox-9基因共轉(zhuǎn)染組。四組培養(yǎng)條件相同，

5、37℃、CO2濃度5％的環(huán)境下用普通的高糖培養(yǎng)基HG-DMEM對細(xì)胞培養(yǎng)2w，以Real-Time PCR、Western-Blot方法對A、B、C、D四組的目的基因TGF-β1和Sox-9表達(dá)情況進(jìn)行檢測。以Western-Blot法測定各組細(xì)胞下游產(chǎn)物的mRNA表達(dá)水平:ACAN、CollagenⅠ、CollagenⅡ、CollagenⅩ。用改良的Courtman法制備纖維環(huán)脫細(xì)胞支架，用HE、電鏡掃描、GAG含量檢測、DNA含量檢

6、測以及免疫源性等評(píng)估脫細(xì)胞纖維環(huán)支架，將纖維環(huán)脫細(xì)胞支架與TGF-β1和Sox-9共轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞混合培養(yǎng)，利用鬼筆環(huán)肽、DAPI及共聚焦顯微鏡來檢測脫細(xì)胞纖維環(huán)支架及細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長情況。
　　研究結(jié)果：
　　課題組獲取分離培養(yǎng)獲取的兔BMSCs干細(xì)胞在經(jīng)過不同的誘導(dǎo)條件處理后具有向成骨、成軟骨以及脂肪細(xì)胞多向分化的能力。對兔BMSCs行流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定，確定了兔BMSCs表面CD31、CD45標(biāo)記物的陰性表達(dá)，CD2

7、9、CD44、CD90等表面標(biāo)記物的陽性表達(dá)。TGF-β1和Sox-9基因測序證明合成基因序列正確無誤。以pLVX-IRES-Puro為穿梭載體構(gòu)建的TGF-β1和Sox-9慢病毒用PCR對DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再行電泳對酶切片段檢測，結(jié)果顯示含有所構(gòu)建的以慢病毒為載體TGF-β1、Sox-9片段。
　　以TGF-β1和Sox-9重組慢病毒共同轉(zhuǎn)染兔BMSCs，用普通的高糖培養(yǎng)基HG-DMEM孵育2w，細(xì)胞形態(tài)隨著時(shí)間推移發(fā)生顯著改變，

8、成明顯梭狀改變。Western-blot方法檢測Sox-9、TGF-β1蛋白表達(dá)增高顯著。培養(yǎng)2w時(shí)，Western-Blot檢測了下游產(chǎn)物的表達(dá)水平，ACAN和Sox-9在單獨(dú)轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染組中表達(dá)沒有顯著差異，CollagenⅡ的表達(dá)在共轉(zhuǎn)染組中要顯著高于各單獨(dú)轉(zhuǎn)染組;ACAN、CollagenⅠ、CollagenⅡ、Sox-9基因的表達(dá)水平較對照組明顯上調(diào)。CollageⅩ基因的表達(dá)在Sox-9單獨(dú)轉(zhuǎn)染組和TGF-β1、Sox-9共

9、轉(zhuǎn)染組中都要明顯低于空載體組和TGF-β1單獨(dú)轉(zhuǎn)染組。以改良Courtman法制備纖維環(huán)脫細(xì)胞支架后，將TGF-β1、Sox-9基因共轉(zhuǎn)染的BMSCs與支架復(fù)合培養(yǎng)，細(xì)胞的增殖狀態(tài)以及下游Ⅱ型膠原的表達(dá)明顯高于普通BMSCs。轉(zhuǎn)基因兔BMSCs能夠均勻的分布于支架表面并生長良好。
　　研究結(jié)論:
　　全骨髓貼壁法在兔BMSCs分離培養(yǎng)的應(yīng)用中具有顯著的可行性，成功獲取大量生長良好的兔BMSCs。以pLVX-IRES-Puro

10、為穿梭載體可以成功構(gòu)建TGF-β1和Sox-9慢病毒，且其可成功共同轉(zhuǎn)染兔BMSCs，獲得TGF-β1和Sox-9雙基因蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。對于TGF-β1和Sox-9慢病毒共轉(zhuǎn)染兔BMSCs后，下游基因CollagenⅩ膠原基因的表達(dá)呈降低趨勢，ACAN、CollagenⅡ基因表達(dá)均明顯升高，共轉(zhuǎn)染后的干細(xì)胞具有明顯的成軟骨能力，表明兔BMSCs向類纖維環(huán)細(xì)胞方向表達(dá)轉(zhuǎn)化。改良后的Courtman脫細(xì)胞法所制備的脫細(xì)胞纖維環(huán)支架能夠適合轉(zhuǎn)