1、前言:誘導分化成為近幾年腫瘤治療的一項新策略。全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)作為經(jīng)典的誘導分化劑已應(yīng)用于急性早幼粒細胞白血病臨床治療中，但有關(guān)實體腫瘤細胞的誘導分化尚處于科學研究階段。喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一。近年來，喉癌在中國尤其東北地區(qū)發(fā)病率呈逐年升高趨勢，放化療的治療效果欠佳，而且患者術(shù)后五年生存率依然較低，缺乏有效的治療措施。因此，研究誘導分化劑對喉癌細胞分化的影響及其調(diào)節(jié)機制，將

2、對尋找喉癌發(fā)生發(fā)展的分子靶標、探索喉癌診斷和治療的新方法產(chǎn)生深遠意義。
　　ATRA通過參與諸多信號通路調(diào)控許多重要生物學過程。ATRA能夠磷酸化p38MAPK并使其核轉(zhuǎn)位入核進而引起Msk1發(fā)生磷酸化，隨后磷酸化Msk1通過募集多種轉(zhuǎn)錄因子至下游靶基因的啟動子區(qū)，調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。此外，ATRA與維甲酸受體(retinoic acid receptor，RAR)結(jié)合能夠抑制PI3K/Akt信號通路，保護GSK-3β不被

3、Akt磷酸化而失去活性。隨后，GSK-3β有機會磷酸化β-catenin并促使其被泛素識別發(fā)生降解，最終導致β-catenin不能進入細胞核與TCF/LEF協(xié)同作用激活包括OCT4和SOX2在內(nèi)的諸多基因。
　　MicroRNA(miRNA)是一類保守性很高，長約20～23個核苷酸的小分子非編碼RNA，通過與靶基因3'非翻譯區(qū)互補結(jié)合使靶基因mRNA降解或翻譯抑制。miRNA通過調(diào)控靶基因參與許多生物學過程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在

4、多種腫瘤中均存在異常表達并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能，是腫瘤診斷治療及預(yù)后判定的重要靶標。miR-27a是近年來發(fā)現(xiàn)的一重要miRNA，作為miR-23a-27a-24-2基因簇成員之一，能夠調(diào)控多種細胞的分化。但有關(guān)miR-27a是否參與喉癌細胞分化未見相關(guān)報道。
　　通過生物信息學軟件預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)GSK-3β和miR-23a-27a-24-2基因簇分別是miR-27a和RARα的潛在靶基因。研究證實，GSK-3β在諸多腫

5、瘤發(fā)生發(fā)展過程中表達異常，且能通過不同信號通路調(diào)控多種細胞分化過程。RARα屬于維甲酸受體家族成員，通常作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，且與多種細胞的分化調(diào)節(jié)有關(guān)。而GSK-3β和RARα是否在喉癌細胞分化中發(fā)揮作用及作用機制尚不清楚。綜上，我們推測ATRA可能通過調(diào)控miR-27a、GSK-3β和RARα三者所在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)誘導喉癌細胞的分化，這也是本研究的主要研究目標和創(chuàng)新之處。
　　因此，本研究擬通過相關(guān)分子生物

6、學技術(shù)檢測全反式維甲酸對喉癌細胞分化的誘導作用及miR-27a對ATRA誘導喉癌細分化的影響，并鑒定miR-27a、GSK-3β和RARα三者的調(diào)控關(guān)系。根據(jù)上述研究結(jié)果進一步探討miR-27a是否通過RARα和GSK-3β相關(guān)信號通路調(diào)控ATRA誘導的喉癌細胞分化，明確miR-27a參與喉癌細胞分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　材料與方法:
　　1、實驗材料:人喉癌細胞系Hep2、人胚腎細胞系HEK293T和喉癌及癌旁組織標本。

7、>　　2、實驗方法:細胞培養(yǎng)、基因瞬時轉(zhuǎn)染實驗、Real-time PCR檢測、Westernblot檢測、熒光素酶報告基因活性檢測、染色質(zhì)免疫沉淀、CCK-8細胞增殖能力檢測、細胞形態(tài)學觀察、統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　1、Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-27a在喉癌組織中表達水平較癌旁組織顯著增高（P＜0.05），而且，隨喉癌組織分化程度升高，miR-27a表達水平逐漸降低（P＜0.05）。
　　2、生

8、物信息學軟件預(yù)測結(jié)果顯示，GSK-3β的3'-UTR區(qū)存在miR-27a結(jié)合位點，提示GSK-3β是miR-27a一潛在靶基因。熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果表明，在HEK293T和Hep2細胞中，miR-27a mimic和野生型表達載體共轉(zhuǎn)染組報告基因活性顯著低于其他對照組（P＜0.05）。
　　3、Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-27a相關(guān)小RNA各轉(zhuǎn)染組Hep2細胞中GSK-3β mRNA表達量無顯著差異(P＞0

9、.05)。Western blot結(jié)果顯示，miR-27a mimic轉(zhuǎn)染組Hep2細胞中GSK-3β蛋白表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05），miR-27a inhibitor轉(zhuǎn)染組Hep2細胞中GSK-3β蛋白表達水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，提示miR-27a抑制GSK-3β翻譯。
　　4、Real-time PCR結(jié)果顯示，隨著ATRA濃度的增加，Hep2細胞中miR-27a表達水平呈逐漸降低的趨勢(P＜0.05)，提示ATR

10、A能夠抑制Hep2細胞中miR-27a的內(nèi)源性表達。
　　5、生物信息學軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-23a-27a-24-2基因簇啟動子區(qū)存在RARα潛在結(jié)合位點。染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果表明，RARα能與miR-23a-27a-24-2基因簇啟動子結(jié)合，且ATRA能夠促進RARα與該啟動子的結(jié)合能力。
　　6、熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果顯示，ATRA能夠顯著降低miR-23a-27a-24-2基因簇啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性，而敲減RAR

11、α則顯著回復(fù)ATRA對其轉(zhuǎn)錄活性的影響（P＜0.05）。
　　7、CCK-8檢測結(jié)果顯示，隨ATRA藥物濃度的增加，Hep2細胞的增殖能力和細胞活力逐漸降低(P＜0.05)。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ATRA處理Hep2細胞后，細胞邊緣發(fā)生皺縮，呈梭型，胞突變長，細胞間隙擴大，生長緩慢;透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ATRA處理Hep2細胞后，細胞表面微絨毛減少，趨于平滑，核質(zhì)比例減小。過表達miR-27a可抑制ATRA引起的Hep2細胞形態(tài)學改變。

12、
　　8、Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，ATRA顯著上調(diào)Involucrin和Keratin10基因mRNA及蛋白表達水平，顯著下調(diào)OCT4和SOX2基因mRNA及蛋白表達水平，而過表達miR-27a或敲減GSK-3β均能顯著回復(fù)ATRA對上述標志物表達水平的影響（P＜0.05）。
　　9、Western blot結(jié)果顯示，ATRA顯著下調(diào)β-catenin和LEF1基因蛋白表達水平，而過表達

13、miR-27a則顯著回復(fù)ATRA對該信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響(P＜0.05)，提示miR-27a抑制ATRA誘導喉癌Hep2細胞分化是通過靶向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。
　　結(jié)論:
　　1、miR-27a在喉癌組織中高表達，與喉癌細胞分化程度呈負相關(guān)并抑制ATRA誘導的喉癌細胞分化。
　　2、RARα作為轉(zhuǎn)錄因子可與miR-27a啟動子區(qū)結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性。
　　3、GSK-3β是mi