1、在酵母細胞自噬研究中，最常用的檢測細胞自噬的方法之一是用熒光蛋白標記自噬相關蛋白。在我們的實驗研究中，會經常用到帶有熒光蛋白標簽的融合蛋白。具體構建方法是在PCR引物中加上45bp左右的目的基因同源片段，然后用擴增的PCR片段轉化酵母，通過酵母細胞的同源重組在目的蛋白的C端連接上熒光蛋白。在大量的實驗研究中，我們發(fā)現(xiàn)這種構建融合蛋白的方法是相當?shù)托У?。酵母細胞中基因同源重組的正確率，在很大程度上取決于兩個基因同源片段的長度。由于PCR引

2、物長度的限制，這個加在PCR引物上的同源片段的長度也是有限的，另外PCR過程中也會存在一定概率的突變。為了提高我們的實驗效率同時降低試驗誤差，我們構建了兩組質粒，用于快速的構建自噬相關蛋白和GFP的融合蛋白。這些質粒的構建原則仍然是利用酵母基因同源重組，但是擴大了同源片段的長度，這樣融合蛋白菌株的構建正確率從原來的10％左右提高到了現(xiàn)在的80％以上。并且構建過程中不再需要PCR，這兩組質粒在很大程度上提高了我們的實驗效率和實驗的重復性。

3、
　　細胞自噬被誘導之后，Atg8通過與脂類分子PE結合，錨定在自噬體膜上。另外有研究指出，Atg8在介導膜延伸的過程中起作用，因此Atg8可以作為標記來追蹤細胞自噬的誘導以及細胞自噬的發(fā)展過程。根據(jù)實驗的需要研究者們構建了GFP-Atg8和RFP-Atg8、cherry-Atg8、tomato-Atg8、dsred-Atg8等融合蛋白用來標記PAS，GFP-Atg8在信號強度和蛋白功能上都是比較理想的。但是這些紅色熒光蛋白標記的

4、Atg8融合蛋白信號很弱，并且融合蛋白的功能也很差，我們希望找到更好的紅色熒光蛋白用來標記Atg8。
　　本論文致力于構建2*dsred和4*dsred以及通過換用不同的連接多肽和啟動子希望能在信號強度上和蛋白功能上能夠改造出更好的紅色熒光蛋白標記的Atg8。到目前為止我們我們找到了一個在信號強度上有很大改進并且蛋白功能有所提高的4*dsred-Atg8，結合我們所構建的兩組其他自噬相關蛋白的GFP融合蛋白的質粒，我們可以很方便的