1、長期慢性缺氧會引起肺動脈高壓，增高的肺動脈壓力導(dǎo)致右心功能不全。有研究報(bào)道，高原型心臟病的發(fā)病關(guān)鍵病理生理學(xué)機(jī)制也在于缺氧性肺動脈高壓（HPH）。了解HPH的發(fā)病機(jī)制是預(yù)防和治療慢性缺氧性肺部疾病導(dǎo)致的右心功能不全和高原型心臟病的關(guān)鍵因素之一。肺動脈高壓的主要病理學(xué)變化特點(diǎn)是缺氧性肺血管收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重建。肥厚的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，血管平滑肌中層肥厚，肺血管重塑過程中平滑肌樣非血管性細(xì)胞的存在可能會導(dǎo)致肺小動脈壁

2、增厚、狹窄內(nèi)徑、肺血管阻力增加，肺動脈壓力升高。長期肺動脈高壓可能導(dǎo)致右心室代償性肥大甚至右心衰竭。肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖、凋亡和遷移是肺血管結(jié)構(gòu)重建中最重要的病理生理學(xué)特點(diǎn)。既往研究往往集中在缺氧及缺氧引起的病理生理學(xué)變化及相關(guān)生物活性分子在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等功能。最近研究結(jié)果顯示，低氧能夠明顯下調(diào)肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）收縮表型標(biāo)記蛋白的表達(dá)，然而，這種具體的下調(diào)機(jī)制還不明確。因此，對PASMCs表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)

3、制的深入研究可以幫助我們解釋其內(nèi)在機(jī)制，包括在缺氧性肺動脈高壓過程中的肺動脈重構(gòu)的機(jī)理。
　　miRNA是一類具有調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)一些正常生理過程或特定的病理和生理過程。miRNA的作用機(jī)制可以從以下兩個(gè)方面來解釋。首先,它通過直接與目標(biāo)mRNA的3′-UTR非翻譯區(qū)結(jié)合降低mRNA的表達(dá)，其次,它通過不完全互補(bǔ)配對和抑制翻譯的過程

4、來調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)。幾項(xiàng)研究已經(jīng)表明, miRNAs參與多種生理過程,如細(xì)胞分化,新陳代謝,細(xì)胞凋亡和增殖。也參與調(diào)節(jié)許多其它的病理過程,如腫瘤發(fā)生,炎癥消退和血管增生。
　　第一部分：miR-23a影響缺氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化
　　目的：探討miR-23a在缺氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌表型轉(zhuǎn)換中的作用及低氧狀態(tài)下miR-23a的表達(dá)機(jī)制。
　　方法：膠原酶消化法提取大鼠PASMCs細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。在PASMC

5、s進(jìn)行缺氧處理（3％O2）后，使用Western Blot免疫印跡法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中SM-MHC，SMα肌動蛋白，Calponin-1，和SM22α蛋白的表達(dá)水平。缺氧條件下，使用mir-23a mimic轉(zhuǎn)染PASMCs細(xì)胞。EdU染色法檢測細(xì)胞增殖活性。
　　結(jié)果：
　　1、缺氧對大鼠PASMCs細(xì)胞的影響一般特點(diǎn)及不同miRNA的篩選
　　原代大鼠平滑肌細(xì)胞生長在培養(yǎng)瓶中貼壁生長，大部分細(xì)胞呈梭形，胞漿豐富，胞質(zhì)密

6、度高。細(xì)胞呈捆狀平行排列，PASMCs細(xì)胞呈峰谷分布特征。使用SM-α肌動蛋白抗體進(jìn)行免疫熒光染色后，我們觀察到在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明亮的綠色絲狀熒光。平均α-肌動蛋白陽性率水平超過95%。與常氧對照組相比，在H24h組中，miR-23a，miR-25，mir-93和miR-106的表達(dá)水平明顯增高。與常氧（N24h）組相比，miRNA表達(dá)水平明顯增加,其表達(dá)水平是常氧組的5.1倍。但miR-143和miR-145表達(dá)水平無明顯變化。觀察缺氧

7、處理48h后miR-23a表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明，缺氧48h后（H48h），與常氧組（N48h）相比，miR-23a表達(dá)水平升高約3.8倍。
　　2、缺氧對大鼠PASMCs收縮表型標(biāo)志蛋白表達(dá)及PASMCs增殖的影響
　　在常氧對照組和缺氧處理組的肺動脈平滑肌細(xì)胞（3%O2，24h或48h）中，檢測SM-MHC，SMα肌動蛋白，Calponin-1和SM22α的表達(dá)水平。結(jié)果表明，SM-MHC，SMα肌動蛋白，Calponi

8、n-1，和SM22α的表達(dá)水平在H24h組明顯低于正常對照組（P＜0.05）。缺氧處理48h后，在PASMCs收縮表型標(biāo)記蛋白明顯低于對照組（N48h）。提示，大鼠PASMCs在缺氧刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。使用EdU染色法觀測常氧及3%O2乏氧狀態(tài)下培養(yǎng)的大鼠原代PASMCs細(xì)胞的增殖活性。乏氧處理后，EdU染色48h陽性率（H48h）明顯低于常氧對照組，表明缺氧處理能顯著增強(qiáng)PASMCs的增殖活性。
　　3、 PASMCs細(xì)胞中，m

9、iR-23a在缺氧誘導(dǎo)的收縮表型標(biāo)記蛋白的表達(dá)下調(diào)的作用
　　與轉(zhuǎn)染空載體miRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-23a抑制劑后，收縮蛋白（SM-MHC，SMA肌動蛋白，Calponin-1，SM22α）表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.05）。在轉(zhuǎn)染miR-23a mimic的PASMCs細(xì)胞中，檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后48h，收縮蛋白標(biāo)記物表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。
　　4、 miR-23a在缺氧誘導(dǎo)PASMCs增殖活性增強(qiáng)中的作用<

10、br>　　缺氧條件下，肺動脈平滑肌細(xì)胞EdU染色陽性率在vehicle和inhibitor ctrl組之間中無顯著性差異。在轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor的PASMCs細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-23a抑制劑后48h， EdU染色陽性率明顯減低，這一結(jié)果表明， miR-23a在促進(jìn)PASMCs缺氧誘導(dǎo)增殖活性中具有重要的作用。在轉(zhuǎn)染mimic對照組的PASMCs細(xì)胞中， EdU染色陽性率與空白組相比，二者未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05

11、）。轉(zhuǎn)染miR-23a mimic48h后，與轉(zhuǎn)染mimic對照組相比，PASMCs細(xì)胞EdU染色陽性率增加（P<0.05）。這一結(jié)果表明，常氧條件下過表達(dá)miR-23a可誘導(dǎo)PASMCs細(xì)胞增殖明顯增加。
　　小結(jié)：缺氧狀態(tài)下，PASMCs收縮表型標(biāo)記蛋白明顯降低，表明缺氧處理能顯著增強(qiáng)PASMCs的增殖活性。缺氧處理后，miR-23a表達(dá)水平升高，并且能夠下調(diào)收縮表型標(biāo)記蛋白的水平，說明其在促進(jìn)PASMCs缺氧誘導(dǎo)增殖活性中具

12、有重要的作用。
　　第二部分：miR-23a在缺氧肺動脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的作用機(jī)制
　　目的：探討miR-23a在缺氧情況下表達(dá)水平上調(diào)的調(diào)控機(jī)制及其病理生理學(xué)意義。
　　方法：先在缺氧條件下使用HIF-1αsiRNA及空白對照siRNA進(jìn)行PASMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)PASMCs細(xì)胞48h后，再使用RT-qPCR方法檢測PASMCs細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平；使用ChIP方法來驗(yàn)證HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)；使

13、用雙熒光素酶報(bào)告基因方法來研究HIF-1α及其結(jié)合位點(diǎn)的作用。
　　結(jié)果：
　　1、 HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)的miRNA-23a表達(dá)上調(diào)中的調(diào)控作用
　　在缺氧條件下，使用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染 PASMCs細(xì)胞后，miR-23a表達(dá)水平明顯減低。這一結(jié)果表明，缺氧條件下miR-23a表達(dá)上調(diào)與HIF-1α有關(guān)。在EDHB(500μM)24h(EDHB24h)組中，與對照組相比，常氧培養(yǎng)PASMCs細(xì)胞HIF-1α

14、蛋白水平和miR-23a表達(dá)水平明顯增高。pri-miR-23a-1， pri-miR-23a-2及 pri-miR-23a-3含量的變化反映出mir-23a-1，mir-23a-2，mir-23a-3轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。當(dāng)PASMCs在缺氧條件下培養(yǎng)并使用HIF-1α特異性siRNA轉(zhuǎn)染后，pri-mir-23a-1和pri-mir-23a-3表達(dá)水平明顯降低，這一結(jié)果表明，HIF-1α參與mir-23a-1和mir-23a-3轉(zhuǎn)錄的激活作

15、用。
　　2、檢測HIF-1α與miR-23a-1和miR-23a-3的上游5KB起始區(qū)的結(jié)合情況。
　　在PASMCs細(xì)胞中，與缺氧處理前（N組）相比，缺氧24h（H24h）和48h（H48h）后，三個(gè)調(diào)節(jié)mir-23a-1非翻譯區(qū)的上游5KB預(yù)測位點(diǎn)（R1， R2，R3）與HIF-1α結(jié)合力明顯增強(qiáng)。在R1中，HIF-1α富集程度最高。與常氧對照組（N）相比，缺氧24h組(H24h)和缺氧48h組（H48h）中， miR

16、-23a-3的非翻譯區(qū)與HIF-1α結(jié)合明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、使用ChIP法檢測HIF-1α在mir-23a-1和mir-23a-3轉(zhuǎn)錄激活中的作用
　　為了進(jìn)一步闡明缺氧對HIF-1α在miR-23a-1和miR-23a-3基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，使用野生型受體基因載體（WT）或突變（M1，M2，M3）及HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在缺氧條件下（1%O2濃度）分別轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞。結(jié)

17、果表明，使用M1，M2,M3突變載體轉(zhuǎn)染后，報(bào)告基因活性明顯下降。轉(zhuǎn)染M3的突變載體報(bào)告基因活性水平最低。缺氧可以明顯增加野生型 Luc-miR-23a-1(WT)熒光素酶活性，但對于突變型Luc-miR-23a-1M3(M3)的熒光素酶活性無明顯影響。此外，野生型和突變型報(bào)告基因載體和HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒及其對照載體共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。結(jié)果顯示，過表達(dá)HIF-1α可以明顯改善野生型luc-mir-23a-1熒光素酶活性（WT）（1

18、.7倍），但對luc-mir-23a-1m3突變組的熒光素酶活性沒有明顯影響（M3）。低氧條件下，干預(yù) HIF-1α能夠顯著削弱野生型Luc-miR-23a-1（WT）熒光素酶活性增強(qiáng)作用。對于miR-23a-3，缺氧條件下（1%氧濃度）與HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染兩種情況，能分別提高野生型Luc-mir-23a-3熒光素酶活性（WT）2.8倍和1.8倍，但對luc-mir-23a-3突變沒有影響（M）。缺氧條件下干預(yù)HIF-1α在能

19、夠顯著削弱野生型Luc-mir-23a-3活性（WT）報(bào)告基因的活性。這些結(jié)果表明，缺氧可以明顯上調(diào)mir-23a-1和mir-23a-3的表達(dá)水平，這是由于HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮作用。
　　小結(jié)：缺氧條件下miR-23a表達(dá)上調(diào)與HIF-1α表達(dá)水平有關(guān)，HIF-1α可以參與mir-23a-1和mir-23a-3的轉(zhuǎn)錄激活作用。miR-23a在缺氧下表達(dá)增加主要是由于mir-23a-1和mir-23a-3上調(diào)引起。缺氧可以明顯

20、上調(diào)mir-23a-1和mir-23a-3的表達(dá)水平，這是由于HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮作用。
　　第三部分:慢性缺氧下大鼠肺中小動脈miR-23a表達(dá)水平、肺動脈平均壓、右心室重量指數(shù)及肺動脈形態(tài)學(xué)的變化
　　目的：構(gòu)建大鼠肺動脈高壓模型，探討慢性缺氧狀態(tài)下肺動脈平滑肌細(xì)胞mir-23a的表達(dá)水平及低氧對大鼠肺動脈平均壓，右心室重量指數(shù)以及肺小動脈壁，內(nèi)膜中層厚度的影響。以期在動物模型中進(jìn)一步闡明慢性缺氧的病理生理學(xué)意義。<

21、br>　　方法： CH組大鼠和常氧下喂養(yǎng)的對照組大鼠（NC組）分別放在模擬海拔5000米的低壓氧艙（Thermo Scientific, Waltham, MA）中喂養(yǎng)21天及正常氧壓條件下喂養(yǎng)。每組隨機(jī)選擇8只大鼠。每只大鼠腹腔注射10%烏拉坦（1ml/100g），處理后大鼠被固定到一個(gè)平臺上，分離右側(cè)頸外靜脈。每只大鼠靜脈注射肝素生理鹽水溶液（0.2ml/100g/100g體重）進(jìn)行全身抗凝。自右心室進(jìn)行肺動脈插管（0.45mm I

22、D和0.8mmOD），使用動力實(shí)驗(yàn)室多導(dǎo)生理記錄儀測量大鼠平均肺動脈壓（mPAP）。處死大鼠，開胸切除心臟。將心房和結(jié)締組織仔細(xì)分離。沿室間隔游離右心室游離壁。用下列公式計(jì)算右心室重量指數(shù)：右心室重量/（左心室+室間隔）重量。
　　結(jié)果：
　　1、慢性缺氧對肺動脈平均壓（mPAP），右心室重量指數(shù)及肺小動脈壁、內(nèi)膜中層厚度的影響。
　　在慢性低氧組（CH）中，肺動脈平均壓明顯升高（P＜0.05），比對照組增加約2倍。提

23、示慢性低氧可顯著提高肺動脈壓。在慢性缺氧組大鼠（CH）中，與常氧對照組（NC）相比，RV/（LV+S）明顯增加（P＜0.05）。提示慢性缺氧可導(dǎo)致大鼠右心室肥厚。我們測量了血管外徑和管壁厚度（外徑-內(nèi)徑），及內(nèi)膜中層厚度。結(jié)果表明，在常氧對照組大鼠（NC）通常肺動脈壁較薄，管腔較大，外徑為81.31±2.8μm，管壁厚度為10.57±2.6μm，內(nèi)膜中層厚度為3.6±0.8μm（表1）。而在慢性缺氧組（CH）大鼠中，肺小動脈外徑為86.

24、61±6.1μm，管壁厚度為21.3±4.4μm，內(nèi)中膜厚度為8.8±1.6μm。
　　2、慢性缺氧狀態(tài)下肺小動脈miR-23a的表達(dá)水平
　　在慢性缺氧組（CH）中，與常氧對照組（NC）相比，肺小動脈miR-23a表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）。
　　小結(jié)：慢性缺氧可導(dǎo)致肺小動脈miR-23a表達(dá)水平明顯增加,并引起大鼠右心室肥厚。慢性缺氧可顯著提高肺小動脈壁的厚度，導(dǎo)致管壁內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞增殖及肺小動脈重構(gòu)。