1、目的：
　　利用不同月齡的大鼠，研究在衰老過程中線粒體順烏頭酸酶(mitochondrialaconitase，m-aconitase，AC02)對線粒體能量代謝的影響及其機制。
　　對象與方法：
　　1.選用不同月齡(1月，8月，16月，24月)的SD雄性大鼠為實驗動物，以大鼠腦組織AC02為研究對象。
　　2.蔗糖密度梯度離心法分離高純度大鼠腦組織線粒體。ACO2活性的檢測是通過340nm處吸光度測定在檸檬酸

2、轉變成α-酮戊二酸的反應過程中NADPH生成的量，從而間接表示順烏頭酸酶活性的大小。檢測不同月齡大鼠腦組織ACO2活性，并用Western Blot和Real Time PCR檢該酶表達水平。
　　3.利用H2O2的強氧化能力，在體外模擬體內(nèi)的氧化損傷。用H2O2處理所提取的線粒體，分別比較不同濃度(0μM，50μM，50μM，100μM，200μM，400μM)的H2O2及不同處理時間(0min，30min，1h，2h)的順烏頭

3、酸酶活性變化。
　　4.測定不同月齡大鼠腦組織非血紅素鐵含量。在酸性條件下，鐵從轉鐵蛋白上游離出來，并沉淀蛋白。上清中的三價鐵被還原為二價鐵，亞鐵離子與菲咯嗪反應形成紫色復合物。在562 nm處測其吸光度，通過標準曲線計算鐵含量。
　　5.利用透射電鏡觀察線粒體在衰老中的形態(tài)變化。通過檢測線粒體膜電位和能量合成研究線粒體在衰老過程中的功能變化。用熒光探針JC-1標記線粒體，分光光度計檢測線粒體膜電位的變化情況。用高效液相色譜

4、法檢測腦組織ATP、ADP、AMP含量并計算能荷。
　　結果：
　　1.Western Blot檢測結果顯示，用蔗糖線性梯度離心法能得到較高純度的線粒體。ACO2活性隨著月齡增加逐漸下降，然而其蛋白表達水平和RNA表達水平在不同月齡間沒有明顯差異。
　　2.在體外氧化壓力作用下，ACO2活性與H2O2的處理濃度和時間呈負相關。
　　3.腦組織非血紅素鐵的含量在衰老過程中逐漸積累。
　　4.衰老大鼠線粒體形態(tài)

5、發(fā)生改變，結構出現(xiàn)不同程度損傷。在衰老過程中，線粒體膜電位降低，ATP合成量與能荷呈明顯下降趨勢。
　　結論：
　　1.ACO2活性中心的[4Fe-4S]2+，易受ROS攻擊而失活。本研究中，H2O2處理后所致的ACO2酶活下降證明了該結論。對不同月齡大鼠ACO2檢測結果證明衰老過程中，機體ROS日益增多，ACO2遭受氧化壓力加重，導致酶活性增齡性遞減。此外，衰老過程中ACO2活性的降低并非其蛋白和基因表達降低，可能是其蛋白

6、結構域受影響而造成該酶的功能缺失。
　　2.衰老過程中伴隨著鐵的積累。衰老過程中產(chǎn)生的過氧化物使鐵蛋白上的鐵游離出來，使得組織鐵含量升高。此外，釋放的Fe經(jīng)過Fenton反應促使更多的ROS產(chǎn)生，加重氧化損傷。
　　3.衰老大鼠線粒體形態(tài)不如年輕組規(guī)則，出現(xiàn)明顯的腫脹和空泡，雙膜解體，嵴不清楚，甚至消失，說明衰老組線粒體結構可能有不同程度損傷。線粒體膜電位和腦組織能荷都隨著衰老進程逐漸降低。ACO2活性降低可能影響TCA循環(huán)