1、背景與目的
　　淋巴瘤是目前發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康。結外NK/T細胞淋巴瘤屬于成熟 T細胞和 NK細胞腫瘤中的一種亞型，在西方國家較為少見，但是在亞洲人、墨西哥人和南美土著人中發(fā)病率較高。在我國，此病是最常見的淋巴瘤類型之一。結外NK/T細胞淋巴瘤具有獨特的臨床病理特征，臨床具有高度侵襲性，由于病變易復發(fā)且對放化療易出現抗拒，預后總體較差。
　　NK/T細胞淋巴瘤發(fā)病機制的復雜性及腫瘤的異質性加大了診斷與

2、治療的困難。目前國際上沒有對標準化的治療方案達成共識，因此使得病人的個體化治療難以實現。新的治療方法比如免疫治療、分子靶向治療也在進一步探索及研究中。因此，開展NK/T細胞淋巴瘤的基礎和臨床研究，為臨床提供有效的治療作用靶點，具有重要意義。
　　MicroRNA（簡稱miRNA）是一種長度約22個核苷酸的內源性的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于植物、動物及 DNA病毒中，在轉錄后水平負向調控靶基因的表達。miRNA的異常表達與腫瘤

3、發(fā)生發(fā)展密切相關，與蛋白編碼基因相同，miRNA也可扮演癌基因或抑癌基因的角色。很多與細胞增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學過程相關的基因被證實為 miRNA的靶基因。最近研究證明， miRNA異常表達與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關系，miRNA表達譜的分析在淋巴瘤診斷、分型及治療靶點的篩選中發(fā)揮重要作用。
　　miR-34a基因定位于染色體1p36，啟動子區(qū)包括P53結合位點和CpG島，由于P53調控失?；駽pG島甲基化可導致miR-

4、34a表達異常。在實體瘤的研究中發(fā)現，miR-34a大多表達下調，miR-34a可以通過靶向調控細胞周期蛋白、細胞周期相關蛋白激酶抑制腫瘤細胞的增殖，還可以通過調控與細胞自噬及衰老有關的細胞調節(jié)因子來影響腫瘤進展，因此在大多數實體瘤中，miR-34a發(fā)揮抑癌基因的作用。但是最近有研究發(fā)現，在一些EBV陽性的淋巴瘤中由EB病毒潛伏膜蛋白（Latent Membrane Protein l，LMP-1）介導的miR-34a表達上調，能促進腫

5、瘤細胞增殖，提示 miR-34a發(fā)揮致癌作用。因此 miR-34a發(fā)揮的生物學功能具有組織特異性。依據我們課題組前期對NK/T細胞淋巴瘤細胞株以及正常NK細胞的小RNA高通量深度測序的研究，發(fā)現在SNK-6和YTS細胞中miR-34a表達下調。而目前關于miR-34a在NK/T細胞淋巴瘤中的表達及生物學功能的研究未見其他文獻報道。
　　本課題利用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PC

6、R）技術檢測miR-34a在NK/T細胞淋巴瘤組織中的表達情況，并進一步分析其與患者臨床病理特征的關系及預后相關性；通過構建高表達miR-34a及低表達miR-34a的重組慢病毒載體并進行包裝，經感染NK/T細胞淋巴瘤細胞系后觀察腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲情況，研究 miR-34a對體外細胞生物學特性的影響；體內構建NK/T細胞淋巴瘤裸鼠移植瘤動物模型，與體外細胞實驗進行比較；通過計算機靶基因預測軟件、熒光素酶報告基因實驗及western

7、-blot實驗確定miR-34a作用的可能的靶基因，對靶基因進行初步驗證，并研究靶基因發(fā)揮的生物學功能。課題旨在探討miR-34a在NK/T細胞淋巴瘤中的作用及意義，尋找與NK/T淋巴瘤診治相關的新的有效靶點。
　　第一部分 miR-34a在NK/T細胞淋巴瘤組織中的表達及臨床意義
　　方法：
　　1.收集并篩選鼻型NK/T細胞淋巴瘤的石蠟組織標本30例，以10例鼻腔粘膜慢性炎的標本作為對照組織。
　　2.采用q

8、RT-PCR的方法檢測NK/T細胞淋巴瘤組織及對照組織中miR-34a相對表達量。
　　3.用SPSS軟件對miR-34a表達與NK/T細胞淋巴瘤患者臨床病理參數的關系進行統(tǒng)計學分析，包括年齡、性別、B癥狀、血清LDH水平、Ann Arbor臨床分期及IPI評分。
　　4.單因素及多因素分析miR-34a表達及以上臨床病理參數與臨床預后的相關性。
　　結果：
　　1.與對照組相比，NK/T淋巴瘤組織中的miR-3

9、4a的表達水平明顯降低。
　　2. miR-34a的表達水平與患者年齡及Ann Arbor臨床分期有關（P＜0.05），而與患者性別、血清LDH水平、B癥狀及IPI評分無關（P＞0.05）。
　　3. miR-34a的表達與患者總生存率無明顯相關性（P＞0.05），IPI評分≥3分為患者預后不良的獨立危險因素。
　　第二部分 miR-34a對NK/T細胞淋巴瘤細胞系的生物學特性影響
　　方法：
　　1.設計

10、引物，以U6為內參，通過RT- PCR的方法檢測正常NK細胞及NK/T細胞淋巴瘤SNK-6和YTS細胞系中miR-34a的表達量。
　　2.設計合成Pre-miR-34a片段和anti-miR-34a片段，同時將慢病毒miRNA表達質粒pLenti-miR和慢病毒miRNA封閉質粒pLenti-anti-miR經過特定酶切位點酶切，與目的片段進行無縫克隆，構建可以上調 miR-34a表達及下調miR-34a表達的重組慢病毒表達載體

11、。
　　3.將重組慢病毒載體、包裝質?！?.2、包膜質粒VSV-G共轉染293T細胞，經過包裝產生病毒原液，并進行滴度測定。
　　4.設計四個實驗組：空白對照組、陰性對照組、miR-34a高表達組和 miR-34a干擾組，分別利用MTT法、流式細胞學及Transwell小室實驗檢測各組感染后的YTS細胞的生長增殖能力、細胞凋亡情況及細胞的侵襲遷移能力。
　　結果：
　　1. miR-34a在YTS和SNK-6淋巴

12、瘤細胞株中的表達與NK細胞株比較，表達明顯下調。
　　2.經過PCR鑒定及測序鑒定，成功構建了可以上調及下調miR-34a表達的重組慢病毒表達載體pLenti-miR-34a和pLenti-anti-miR34a。
　　3. MTT實驗結果發(fā)現，在感染72h后miR-34a高表達組、miR-34a干擾組和對照組各組之間兩兩比較，吸光度均有顯著差異（P＜0.05）。與對照組相比， miR-34a高表達組吸光度顯著降低，而miR

13、-34a干擾組吸光度顯著升高。
　　4.流式細胞學檢測結果發(fā)現，miR-34a高表達組與陰性對照組、miR-34a干擾組相比，細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　5. Transwell小室法檢測結果發(fā)現，miR-34a高表達組、miR-34a干擾組和對照組各組之間兩兩比較，穿膜細胞數均有顯著差異（P＜0.05），miR-34a高表達組穿膜細胞數明顯減少而miR-34a干擾組穿膜細胞數明顯增多。

14、>　　第三部分 miR-34a靶基因預測及功能初步驗證
　　方法：
　　1.利用生物信息學軟件TargetScan、PicTar和Miranda分別預測miR-34a作用的靶基因。
　　2.將 pmirGLO載體的雙酶切產物，與目的基因 CD47-3’UTR、MYB-3’UTR、MYC-3’UTR的 PCR產物進行無縫克隆，構建重組載體 pmirGLO-CD47、pmirGLO-MYB和pmirGLO-MYC。

15、　　3.設計五個實驗組：pmirGLO-CD47、pmirGLO-MYB和pmirGLO-MYC，陰性對照組PmirGLO-control及空白對照組，分組與Lenti-miR34a慢病毒共轉染293T細胞，進行雙熒光素酶報告基因分析。
　　4.設計四個實驗組：空白對照組（未感染YTS細胞）、陰性對照組（Lenti-con）、Lenti-miR34a組和Lenti-anti-miR34a組，各組感染YTS細胞后，應用RT-PCR檢

16、測各處理組 CD47mRNA的相對表達量，Western Blot實驗檢測各處理組CD47蛋白的表達水平。
　　5.設計靶向CD47的shRNA序列并轉染至YTS細胞，RT-PCR及Western Blot實驗檢測轉染后CD47的mRNA及蛋白表達情況。檢測分為細胞對照組、陰性對照組、mir34a過表達組和CD47shRNA干擾表達組，分別利用MTT法、流式細胞學及Transwell小室實驗檢測各組感染后的YTS細胞的生物學功能。

17、
　　結果：
　　1.生物信息學軟件預測CD47、MYB和MYC為miR-34a可能作用的靶基因。
　　2.經過 PCR鑒定及測序鑒定，成功構建了重組載體 pmirGLO-CD47、pmirGLO-MYB和pmirGLO-MYC。
　　3.雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與對照組相比，pmirGLO-CD47實驗組熒光素酶活性明顯下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而 pmirGLO-MYB實驗組和pmirGLO-M

18、YC實驗組差異不具有顯著性(P＞0.05)。證明 miR-34a能夠與CD47的3’UTR區(qū)特異性結合。
　　4. RT-PCR檢測結果顯示與對照組相比，Lenti-miR34a組和 Lenti-anti-miR34a組的CD47mRNA表達水平無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。Western Blot實驗結果顯示 Lenti-miR34a組、Lenti-anti-miR34a組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Le

19、nti-miR34a感染組細胞的 CD47蛋白表達水平明顯低于對照組，而Lenti-anti-miR34a感染組細胞的CD47蛋白表達水平顯著高于對照組。
　　5.轉染CD47-shRNA后，CD47-shRNA組的CD47mRNA水平及蛋白水平均明顯下降，證實慢病毒干擾載體構建成功。MTT實驗結果顯示，miR34a組及CD47-shRNA組與對照組相比，在48h，72h和96h時的細胞吸光度值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（ p<0

20、.05）。流式細胞學結果顯示， miR-34a組和CD47-shRNA組與對照組相比，凋亡細胞數量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Transwell小室實驗結果顯示，miR-34a組和CD47-shRNA組較之對照組，遷移穿膜細胞數明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　第四部分 miR-34a對NK/T細胞淋巴瘤裸鼠移植瘤的影響
　　方法：
　　1.建立人NK/T細胞淋巴瘤裸鼠移植瘤動物模型。設

21、計實驗組：陰性對照組、Lenti-miR34a組和 Lenti-anti-miR34a組。觀察各組種植瘤生長情況，測量腫瘤體積并繪制生長曲線。實驗終止時處死小鼠，分離腫瘤。
　　2.采用HE染色、免疫組化和原位雜交方法檢測各組移植瘤病理組織學形態(tài)、免疫表型及EBV感染情況。
　　3.采用TUNEL法檢測各組移植瘤組織中細胞凋亡率。
　　結果：
　　1． Lenti-miR34a組裸鼠移植瘤體積明顯小于對照組和Le

22、nti-anti-miR34a組裸鼠移植瘤體積，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2． HE染色顯示各組移植瘤大體形態(tài)及顯微鏡下組織學形態(tài)相似。免疫組化顯示各組移植瘤CD3、CD56、Granzyme-B、TIA-1均表達陽性，CD20表達陰性。EBER原位雜交顯示各組移植瘤均 EBV陽性。免疫組化結果顯示Lenti-anti-miR34a組裸鼠移植瘤組織中 CD47蛋白表達高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；L

23、enti-miR34a組裸鼠移植瘤組織中 CD47蛋白表達明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3． TUNEL結果顯示與對照組和Lenti-anti-miR34a組相比，Lenti-miR34a組移植瘤組織中凋亡細胞明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　1. miR-34a在 NK/T淋巴瘤石蠟組織及細胞系中的表達均下調，提示其可能參與了NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。

24、　　2.成功構建了可以上調及下調miR-34a表達的重組慢病毒表達載體，體外實驗證實高表達miR-34a能抑制腫瘤細胞的生長增殖，促進腫瘤細胞凋亡，并減低腫瘤細胞的侵襲轉移能力。
　　3. CD47是miR-34a直接作用的靶基因，miR-34a能夠與CD47的3’UTR區(qū)特異性結合進行轉錄后負向調控，發(fā)揮相應生物學功能。
　　4.成功構建了人NK/T細胞淋巴瘤裸鼠移植瘤動物模型，體內動物實驗與體外細胞實驗結果相似，證明mi