1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 膀胱癌尿液microRNAs RT-qPCR檢測最適內(nèi)參基因的選擇與驗(yàn)證
　　目的：
　　本研究旨在對膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測的內(nèi)參基因進(jìn)行系統(tǒng)篩選和驗(yàn)證，確定可用于膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測的最適內(nèi)參基因。
　　方法：
　　1.收集6例膀胱癌和6例健康對照尿液上清，采用Miseq高通量測序技術(shù)對兩組樣本進(jìn)行分析，選擇拷

2、貝數(shù)大于50，在兩組樣本中表達(dá)無差異且在兩組之間倍數(shù)小于1.2的miRNAs分子作為候選的內(nèi)參基因。
　　2.采用RT-qPCR技術(shù)在80例膀胱癌和80例健康對照尿液上清中對測序篩選出的候選內(nèi)參基因和目前常用內(nèi)參基因U6snRNA進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　3.利用NormFinder和geNorm軟件評估內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，確定最適的內(nèi)參基因。
　　4.采用RT-qPCR技術(shù)在63例膀胱癌和63例健康對照尿液上清中對篩選確

3、定的最適內(nèi)參基因進(jìn)行評估。
　　結(jié)果：
　　1.候選內(nèi)參基因的測序篩選:膀胱癌組和健康對照者組比較發(fā)現(xiàn)，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，拷貝數(shù)大于50，兩組間表達(dá)無差異且兩組倍數(shù)小于1.2的miRNAs分子為13個(gè)，同時(shí)也將U6snRNA作為候選內(nèi)參基因納入進(jìn)行下一步驗(yàn)證。
　　2.候選內(nèi)參基因的RT-qPCR驗(yàn)證:在上述14個(gè)候選的內(nèi)參基因中，有4個(gè)miRNAs分子在尿液上清標(biāo)本中無法檢測到;2個(gè)miRNAs分子（miR-194-5p

4、和miR-99b-5p）的PT-qPCR檢測的平均Cq值大于35;7個(gè)miRNAs和U6snRNA在所有尿液上清樣本中均可檢測到且Cq均值小于35。
　　3.確定的內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性評估:利用NormFinder和geNorm兩個(gè)軟件評估上述7個(gè)確定的miRNAs分子和U6snRNA的穩(wěn)定性，兩個(gè)軟件均顯示let-7b-5p是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，let-7b-5p和miR-532-5p組合是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合。
　　結(jié)

5、論：
　　let-7b-5p和miR-532-5p組合可作為膀胱癌和健康對照尿液游離miRNAsRT-qPCR檢測的最適內(nèi)參基因。
　　第二部分 基于尿液microRNAs表達(dá)譜的膀胱癌診斷模型的構(gòu)建及臨床應(yīng)用研究
　　目的：
　　本研究旨在系統(tǒng)篩選膀胱癌特異尿液游離miRNAs表達(dá)譜，進(jìn)一步運(yùn)用logistic回歸分析構(gòu)建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌診斷模型用于膀胱癌的診斷。
　　方法：
　　1

6、.收集6例膀胱癌和6例健康對照尿液上清，采用Miseq高通量測序技術(shù)對兩組樣本進(jìn)行分析，選擇在兩組樣本中表達(dá)呈顯著差異且兩組之間倍數(shù)大于2的miRNAs作為候選miRNAs分子。
　　2.采用RT-qPCR技術(shù)在150例膀胱癌和150例健康對照尿液上清中對上一步測序篩選出的候選miRNAs分子進(jìn)行驗(yàn)證。并采用受試者工作曲線(ROC)評估驗(yàn)證后的呈差異表達(dá)的miRNAs分子對膀胱癌的診斷效能。
　　3.通過logistic回歸

7、分析將驗(yàn)證出的對膀胱癌具有診斷價(jià)值的miRNAs分子構(gòu)建膀胱癌診斷模型。
　　結(jié)果：
　　1.差異miRNAs測序篩選:高通量測序結(jié)果顯示，膀胱癌和健康對照尿液上清中拷貝數(shù)大于50的miRNAs分子分別為256和308個(gè)。在兩組間表達(dá)呈顯著差異且倍數(shù)大于2的miRNAs分子為23個(gè)，其中在膀胱癌組中呈高表達(dá)的為16個(gè)。
　　2.差異miRNAs分子的RT-qPCR驗(yàn)證:將上述23個(gè)呈差異表達(dá)的miRNAs分子在150例

8、膀胱癌和150例健康對照尿液上清中進(jìn)行RT-qPCR檢測驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p和miR-375在膀胱癌組的表達(dá)顯著高于健康對照組（均P＜0.05），miR-200a-3p和miR-423-5p在膀胱癌組的表達(dá)顯著低于健康對照組（均P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　尿液游離miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p、m

9、iR-375、miR-200a-3p和miR-423-5p可以作為潛在腫瘤標(biāo)志物用于膀胱癌的診斷，構(gòu)建的7-miRNAs診斷模型能夠用于膀胱癌的早期診斷，并且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測;miR-22-3p和miR-200a-3p為非肌層浸潤性膀胱癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因子。上述結(jié)果為膀胱癌的無創(chuàng)性診斷和非肌層浸潤性膀胱癌的復(fù)發(fā)預(yù)測提供了一條的新的途徑。
　　第三部分 基于尿液microRNAs表達(dá)譜的膀胱癌分期預(yù)測模型的構(gòu)建及臨床應(yīng)

10、用
　　目的：
　　本研究旨在篩選肌層浸潤性膀胱癌特異尿液游離miRNAs表達(dá)譜，進(jìn)而采用logistic回歸分析構(gòu)建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌分期預(yù)測模型用于肌層浸潤性膀胱癌的術(shù)前預(yù)測。
　　方法：
　　1.收集6例肌層浸潤性膀胱癌、6例非肌層浸潤性膀胱癌和6例健康對照尿液上清，采用Miseq高通量測序技術(shù)對三組樣本進(jìn)行分析，初步篩選差異表達(dá)miRNAs作為候選miRNAs分子。
　　2.采用RT-

11、qPCR技術(shù)在113例肌層浸潤性膀胱癌、113非例肌層浸潤性膀胱癌和156例健康對照尿液上清中對測序篩選出的候選miRNAs分子進(jìn)行驗(yàn)證。確定肌層浸潤性膀胱癌特異的miRNAs分子，采用受試者工作曲線(ROC)評估上述特異的miRNAs分子對肌層浸潤性膀胱癌的預(yù)測效能。
　　3.運(yùn)用logistic回歸分析將驗(yàn)證出的對肌層浸潤性膀胱癌具有預(yù)測價(jià)值的miRNAs分子構(gòu)建膀胱癌分期預(yù)測模型。
　　結(jié)果：
　　1.差異miR

12、NAs測序篩選:高通量測序結(jié)果顯示，大于50個(gè)拷貝的miRNAs分子在肌層浸潤性膀胱癌中為235個(gè)，非肌層浸潤性膀胱癌中為188個(gè)，健康對照者中為276個(gè)。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，大于50拷貝，在三組之間兩兩表達(dá)呈顯著差異且倍數(shù)大于2的miRNAs分子為24個(gè)。
　　2.候選miRNAs分子的RT-qPCR驗(yàn)證:將上述24個(gè)差異表達(dá)的miRNAs分子在113例肌層浸潤性膀胱癌、113例非肌層浸潤性膀胱癌和156例健康對照中尿液上清中進(jìn)行RT

13、-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-24-3p和miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組表達(dá)顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌組和健康對照組（均P＜0.05），同時(shí)，其在非肌層浸潤性膀胱癌組表達(dá)顯著高于健康對照組（均P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　尿液游離miR-24-3p和miR-1246可以作為潛在腫瘤標(biāo)志物用于膀胱癌的分期預(yù)測，構(gòu)建的2-miRNAs膀胱癌分期預(yù)測模型能夠在術(shù)前預(yù)測肌層浸潤性膀胱癌，并且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測

14、和病理分級;miR-24-3p為肌層浸潤性膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立判斷因子。上述結(jié)果為肌層浸潤性膀胱癌的術(shù)前預(yù)測和預(yù)后判斷提供了一條的新的途徑。
　　關(guān)鍵詞:肌層浸潤性膀胱癌;microRNAs;腫瘤標(biāo)志物;預(yù)測;預(yù)后
　　第四部分 microRNAs分子在膀胱癌組織中表達(dá)及生物學(xué)功能研究
　　目的：
　　本研究旨在檢測膀胱癌分期預(yù)測模型中的microRNAs (miRNAs)分子在肌層浸潤性膀胱癌和非肌層浸潤性膀胱癌組

15、織中的表達(dá)情況。通過體外調(diào)控膀胱癌細(xì)胞系中miRNAs分子的表達(dá)水平，進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，探討上述miRNAs分子在膀胱癌增殖、遷移、侵襲及凋亡等過程中的生物學(xué)功能，明確其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找膀胱癌潛在的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用RT-qPCR技術(shù)檢測35例肌層浸潤性膀胱癌及35例非肌層浸潤性膀胱癌新鮮冰凍組織及T24膀胱癌細(xì)胞系中miR-24-3p和miR-1246的表達(dá)情況。選取差異表

16、達(dá)miRNAs分子，進(jìn)一步檢測其在肌層浸潤性膀胱癌組織及配對癌旁正常組織中的表達(dá)情況。
　　2.體外用脂質(zhì)體2000將miR-1246 mimics、miR-1246 inhibitor和對應(yīng)的陰性對照序列轉(zhuǎn)染T24膀胱癌細(xì)胞系，同時(shí)利用RT-qPCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果：
　　1.結(jié)果顯示，miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組織中的表達(dá)水平顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌組織(P＜0.05)，而miR-24-3p表

17、達(dá)在肌層浸潤性膀胱癌組織與非肌層浸潤性膀胱癌組織之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.相比于mock組和miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-1246mimics24小時(shí)后，T24膀胱癌細(xì)胞中miR-1246的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.001)。相比于mock組和miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor24小時(shí)后，T24膀胱癌細(xì)胞中miR-1246的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜ 0.05）。
　　3.相比于mock

18、組和miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-1246 mimics的T24膀胱癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)增殖均明顯增快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　相比于非肌層浸潤性膀胱癌，miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)。進(jìn)一步體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-1246在膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，顯著促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展。本研究將為尋找膀胱癌新的治療靶點(diǎn)提供理論依