1、海參（Sea Cucumber）是我國重要的海水養(yǎng)殖物種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。由于海參的營養(yǎng)價值和藥用價值，海參產(chǎn)業(yè)在亞洲國家迅猛發(fā)展。然而，海參很容易被多種細(xì)菌、寄生蟲和病毒感染，例如，細(xì)菌感染導(dǎo)致的腐皮綜合征會引起海參體壁肌肉潰瘍、唇腫脹、自溶甚至是死亡，這嚴(yán)重制約了海參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前，針對病害問題采用的藥物治療方法，不僅容易使海參產(chǎn)生抗藥性，而且還會破壞水質(zhì)，影響生態(tài)環(huán)境；采用生物防治的方法，開發(fā)海參綠色制劑是大勢所趨。凝集素

2、是一類具有識別特殊碳鏈基團(tuán)的蛋白質(zhì)，具有抗病毒、抗真菌和抗腫瘤等多種優(yōu)點(diǎn)，在海參的先天免疫中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本文以刺參（Apostichopus japonicus）體壁總RNA為模板，應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）克隆出兩個新型C型凝集素基因（C-type lectins）AjL和AjMBCL，通過原核表達(dá)技術(shù)獲得凝集素融合蛋白，并鑒定融合蛋白活性?？寺〉玫降腁jL基因CDS為492bp，編碼1

3、63個氨基酸，其中，氨基酸序列1～20為信號肽區(qū)域，成熟肽區(qū)由143個氨基酸組成，理論蛋白分子質(zhì)量為17705.7道爾頓，等電點(diǎn)為4.48；AjMBCL基因的CDS為537bp，編碼178個氨基酸，其中，1～21位為信號肽區(qū)，22～178位氨基酸序列組成成熟肽區(qū)域，AjMBCL的理論蛋白分子量為19880.2道爾頓，等電點(diǎn)為6.98。通過氨基酸序列分析、多重序列比對和進(jìn)化樹構(gòu)建等生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，成功克隆到刺參凝集素基因AjL和A

4、jMBCL。本實(shí)驗(yàn)的原核表達(dá)采用大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)體系，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出凝集素基因AjL和AjMBCL的開放閱讀框片段，將目的基因連接到pET-32a(+)載體并構(gòu)建重組子pET-32a-AjL和pET-32a-AjMBCL；將重組子轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，37℃，培養(yǎng)菌至OD600到0.45-0.6之間，28℃，IPTG（0.5mM/mL）緩慢誘導(dǎo)過夜；誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白AjL分子量為34KDa左右，AjMBCL融合蛋白表達(dá)

5、的分子量為30KDa左右。融合蛋白的純化采用鎳離子親和層析方法，其原理是帶組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白與鎳離子具有較高親和力，用高濃度的咪唑可競爭洗脫出目的融合蛋白，該方法簡單、高效、純化效果好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。凝集素的顯著特性就是能夠凝集紅細(xì)胞，本研究將處理好的紅細(xì)胞懸液與純化的融合蛋白在室溫下混勻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞出現(xiàn)聚集且不能被吹散，說明本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的融合蛋白 AjL和 AjMBCL具有凝血活性，最低凝集濃度分別為0.085mg/ml和0.