1、腦卒中(stroke)是位列世界人類死亡及致殘?jiān)虻诙坏某Ｒ姴?、多發(fā)病，而急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是最常見的腦卒中類型，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。AIS的發(fā)病是以血流以及梗死區(qū)葡萄糖和能量供應(yīng)的突然中斷為開端，繼而導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。盡管隨后的再灌注可以迅速恢復(fù)缺血腦組織的正常血供和功能，但也會(huì)引起繼發(fā)性損傷，即缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷。

2、腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)包括一系列的病理級聯(lián)反應(yīng)：興奮性氨基酸(EAAs)毒性、鈣內(nèi)流、自由基積聚、炎癥反應(yīng)、血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞、腦水腫和細(xì)胞凋亡等。因此，尋找針對CIRI的防治方法一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要任務(wù)。
　　腦保護(hù)和損傷修復(fù)策略對于CIRI的防治具有重要意義。近年來，腦卒中的治療技術(shù)和藥物均不斷地發(fā)展

3、、進(jìn)步，但針對CIRI有效的藥物往往在臨床轉(zhuǎn)化的過程中遭遇失敗。究其原因在于：其治療的重心僅局限在單一的治療靶點(diǎn)，忽略了不同治療靶點(diǎn)之間的相互作用。因此，急需新的研究策略來預(yù)防和治療CIRI。
　　基于上述策略，學(xué)者們提出了神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)的概念。NVU可以看作是大腦的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，主要結(jié)構(gòu)包括：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其基膜、周細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)。NV

4、U強(qiáng)調(diào)了上述細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用以及它們在大腦病理生理機(jī)制中的作用，因此，NVU已成為研究腦卒中多靶點(diǎn)、多水平聯(lián)合治療的重要模型。根據(jù)NVU的概念，本實(shí)驗(yàn)室利用原代培養(yǎng)的SD大鼠大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元三種細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，構(gòu)建了一種體外NVU模型——SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型；該模型能夠用于大腦疾病的相關(guān)研究、潛在藥物靶

5、點(diǎn)的篩選以及治療藥物的開發(fā)。
　　傳統(tǒng)中草藥以其多作用靶點(diǎn)、高安全性的特點(diǎn)，在治療CIRI方面展現(xiàn)出得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。丹參是一種廣泛應(yīng)用于各種心腦血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病治療的傳統(tǒng)中草藥，隱丹參酮(cryptotanshinone，CTs)則是從丹參根部提取出的一種重要的丹參酮，它是一種脂溶性的小分子，易于通過BBB?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，CTs不但具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗凋亡、抗糖尿病及減肥的作用，還具有防治缺血性疾病、

6、動(dòng)脈粥樣硬化及Alzheimer’s病的作用。近年來，也有學(xué)者關(guān)注到CTs與I/R損傷之間的關(guān)系。已有研究者證實(shí)，CTs具有保護(hù)心肌I/R損傷和肝I/R損傷的作用；然而CTs對CIRI(特別是在細(xì)胞水平)的保護(hù)作用及其機(jī)制尚未闡明。明確CTs對CIRI的神經(jīng)保護(hù)作用可以為腦保護(hù)機(jī)制的研究以及藥物的篩選提供新的思路。
　　氧糖剝奪/復(fù)氧糖(oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/

7、R)是一種常用的、體外模擬CIRI的方法，其病理改變與在體CIRI時(shí)腦細(xì)胞和BBB的病理改變基本相似。故而，本課題中，我們利用OGD/R損傷的SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，觀察CTs對SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷的干預(yù)作用，并對其可能的干預(yù)機(jī)制進(jìn)行深入探討。
　　第一部分 SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型氧糖剝奪/復(fù)氧糖損傷模型的建立
　　目的：選擇適宜的OGD/R處理?xiàng)l件，在細(xì)胞水平建立一種可靠的、簡便易行的體外

8、NVU的氧糖剝奪/復(fù)氧糖(OGD/R)模型，為研究CTs對CIRI的干預(yù)作用及其機(jī)制的探討奠定基礎(chǔ)。
　　方法：利用體外原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，提取、培養(yǎng)SD大鼠大腦皮質(zhì)BMECs、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，并進(jìn)行純度鑒定；利用transwell insert將上述三種細(xì)胞共培養(yǎng)，在體外構(gòu)建SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型；設(shè)立正常對照組和OGD/R組，每組又分設(shè)R0h、0.5h、3h、6h、12h、24h和72h共7個(gè)不同復(fù)氧糖時(shí)間組，各設(shè)兩

9、個(gè)復(fù)孔，OGD/R組采用OGD2h后復(fù)氧糖處理；應(yīng)用試劑盒檢測模型中細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性和三種細(xì)胞的細(xì)胞活力；應(yīng)用ERS-2 System電阻儀，檢測SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型TEER值。
　　結(jié)果：
　　1. BMECs原代培養(yǎng)7d后成熟，經(jīng)血管內(nèi)皮相關(guān)因子VIII抗體免疫熒光染色鑒定，細(xì)胞純度>95%。
　　2.星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)10d后傳代，第二代培養(yǎng)

10、9d成熟，經(jīng)GFAP免疫熒光染色鑒定，細(xì)胞純度>90%。
　　3.神經(jīng)元原代培養(yǎng)7 d后成熟，經(jīng)MAP2免疫熒光染色鑒定，細(xì)胞純度>90%。
　　4.利用transwell insert將BMECs、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)，共培養(yǎng)的第3 d到第5 d，TEER值趨于穩(wěn)定(P>0.05)。
　　5. SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD2h處理后，開始復(fù)氧糖(R)處理：(1)R3h時(shí)：神經(jīng)元的細(xì)胞活力開始下降(P＜0.

11、01)，且R24h和R72h時(shí)較R3h時(shí)下降得更顯著(P均＜0.01)。(2)R6h時(shí)：BMECs和星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率才開始下降(P均＜0.05)，且R24h和R72h時(shí)較R6h時(shí)下降得更顯著(P均＜0.01)；細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性開始增加(P＜0.01)，且R24h和R72h時(shí)較R6h時(shí)增加得更顯著(P均＜0.01)；TEER值開始下降(P＜0.05)，且R12h、R24h和R72h時(shí)較R6h時(shí)下降得更為顯著(P分別為＜0.05，＜

12、0.01和＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1. SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型經(jīng)OGD2h/R24h處理后，被成功地構(gòu)建為OGD/R損傷模型。
　　2. TEER值的降低可作為判斷SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷模型成功構(gòu)建的檢測指標(biāo)。
　　第二部分隱丹參酮對SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型氧糖剝奪/復(fù)氧糖損傷的干預(yù)作用
　　目的：觀察CTs對SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷的干預(yù)作用，驗(yàn)證C

13、Ts對CIRI的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法：(1)利用成功構(gòu)建的SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，將0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、50和100μM共9種不同濃度CTs作用于模型24 h后，用CCK-8的方法，檢測模型中神經(jīng)元的毒性，選擇適宜的CTs濃度。(2)利用SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，設(shè)立預(yù)處理給藥組和即刻給藥組，每個(gè)組再分設(shè)正常對照組和各適宜CTs濃度組，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，除正常對照組之外均采用OGD2h/R

14、24h處理；應(yīng)用LDH檢測試劑盒，檢測OGD/R損傷后的細(xì)胞損傷程度，確定最佳給藥方式和有效劑量。(3)利用SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，設(shè)立正常對照組、OGD2h/R24h組、CTs2.5μM組和CTs5.0μM組，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，除正常對照組之外均采用OGD2h/R24h處理；倒置顯微鏡下觀察模型中三種細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)；應(yīng)用檢測試劑盒，檢測模型中三種細(xì)胞的細(xì)胞活力及細(xì)胞損傷程度的干預(yù)作用。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的CT

15、s作用于SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型24 h后，0.2、0.5、1.0、2.5、5.0和10μM CTs對神經(jīng)元細(xì)胞活力無明顯影響(P>0.05)。
　　2.預(yù)處理給藥組中，與OGD2h/R24h組相比，CTs1.0、2.5、5.0和10μM組LDH活性均明顯降低(P分別為＜0.05，0.01，0.01和0.05)。即刻給藥組中，與OGD2h/R24h組相比，各CTs組LDH活性無明顯差異(P均>0.05)。
　　3.無論是

16、CTs2.5μM組還是CTs5.0μM組均可修復(fù)OGD/R損傷所造成的BMECs、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的各種病理性形態(tài)學(xué)改變，明顯提高三種細(xì)胞的細(xì)胞活力(P均＜0.01)，降低細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性(P分別為＜0.05和＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1. CTs對SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷的最佳給藥方式為預(yù)處理給藥，有效劑量為2.5和5.0μM。
　　2. CTs預(yù)處理能夠恢復(fù)OGD/R損傷引起的細(xì)胞收

17、縮，減少細(xì)胞脫落，提高細(xì)胞活力，減少細(xì)胞損傷，對SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷具有保護(hù)作用。
　　第三部分隱丹參酮對SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型氧糖剝奪/復(fù)氧糖損傷的干預(yù)作用機(jī)制
　　目的：探討CTs對SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷的干預(yù)作用機(jī)制，為腦保護(hù)機(jī)制的研究以及藥物的篩選提供新的思路。
　　方法：利用SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，設(shè)立正常對照組、OGD2h/R24h組、CTs2.5μM組

18、和CTs5.0μM組，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，除正常對照組之外均采用OGD2h/R24h處理；應(yīng)用檢測試劑盒，檢測神經(jīng)元內(nèi)ROS含量以及細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量、SOD活力和NO含量；應(yīng)用ELISA法，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量；應(yīng)用TUNEL法，檢測神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用ERS-2 System電阻儀，檢測TEER值；應(yīng)用熒光化學(xué)發(fā)光檢測儀，檢測BMECs對NaF的通透量；應(yīng)用Western blot法，檢測 CTs

19、對 OGD/R損傷后神經(jīng)元的Caspase-3、cleaved-Caspase-3、PARP、cleaved-PARP、Bax、Bcl-2和MAPKs表達(dá)以及BMECs的ZO-1、Occludin、Claudin-5、MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1. CTs預(yù)處理可使SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷后神經(jīng)元內(nèi)的ROS水平、細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA和NO水平降低(P均＜0.01)，而使細(xì)胞培養(yǎng)液中

20、的SOD活力增高(P＜0.01)。
　　2. CTs預(yù)處理可使SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷后細(xì)胞培養(yǎng)液中的促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平降低(P均＜0.01)。
　　3. CTs預(yù)處理可使SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.01)，cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP的表達(dá)降低(P均＜0.01)。
　　4. CTs預(yù)處理可使SD大

21、鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷后神經(jīng)元Bcl-2的表達(dá)增加、Bax的表達(dá)降低(P均＜0.01)，從而使Bcl-2/Bax比值增大；
　　5.CTs預(yù)處理可使SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷后神經(jīng)元p-JNK和p-p38 MAPK的表達(dá)降低(P均＜0.01)。
　　6. CTs預(yù)處理可使SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷后TEER值增高(P＜0.01)，BMECs對NaF的通透量降低(P＜0.01)；B

22、MECs中ZO-1、Occludin和Claudin-5表達(dá)增加，而MMP-9表達(dá)降低(P均＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1. CTs對SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型OGD/R損傷的干預(yù)作用與抗氧化、抗炎、抗神經(jīng)元凋亡以及改善BBB功能的機(jī)制有關(guān)。
　　2. CTs抑制SD大鼠重要大腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型中OGD/R損傷神經(jīng)元凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá)以及抑制JNK和p38 MAPK信號通路相關(guān)。
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