1、溴隱亭(Bromocriptine，BC)耐藥是垂體泌乳素腺瘤藥物治療無效或復發(fā)的關鍵因素，探索垂體泌乳素腺瘤對藥物BC產生耐藥性的原因并對耐藥垂體泌乳素腺瘤患者進行準確診斷有利于實施個體化治療，提高治療效果。本論文首先采用高效液相色譜(HPLC)與串聯(lián)質譜(MS/MS)聯(lián)用技術，建立了靈敏、快速的適用于臨床垂體泌乳素腺瘤患者的血漿和腫瘤組織中藥物BC的定量分析方法。采用該方法比較分析了耐藥型與敏感型垂體泌乳素腺瘤患者的血漿及腫瘤組織中

2、藥物BC的分布差異，發(fā)現(xiàn)藥物BC在耐藥患者體內也能夠被有效地吸收和轉運至腫瘤組織，在腫瘤組織中維持較高的含量，耐藥型垂體泌乳素腺瘤患者經BC治療無效的原因可能是腫瘤細胞自身對藥物產生的耐藥性。在上述研究基礎上，進一步采用基于LC-MS/MS技術的代謝組學方法，分別以臨床垂體泌乳素腺瘤患者的血漿和大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞為研究對象，開展了垂體泌乳素腺瘤藥物BC的耐藥性研究。篩選出一批與耐藥相關的潛在生物標志物，并利用發(fā)現(xiàn)的生物標志物進行了代

3、謝通路分析，在BC耐藥垂體泌乳素腺瘤患者和耐藥腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了與耐藥相關的發(fā)生紊亂的代謝通路。本研究結果為臨床BC耐藥垂體泌乳素腺瘤的耐藥性機制提供了分子基礎及重要依據(jù)。
　　本論文的研究內容主要包括以下三個部分:
　　1.臨床患者血漿及垂體泌乳素腺瘤組織中藥物溴隱亭的定量分析
　　采用LC-MS/MS技術，通過對色譜條件和MRM檢測模式下質譜參數(shù)的系統(tǒng)優(yōu)化，建立了靈敏、快速、專屬性強，適用于臨床人體血漿和腫瘤組織中藥

4、物BC的定量分析方法。采用該方法對耐藥型和敏感型垂體泌乳素腺瘤患者的血漿及腫瘤組織中藥物BC進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)耐藥患者口服BC2，4和6h后，體內血漿藥物濃度明顯高于敏感患者;服藥3個月后的耐藥患者腫瘤組織中的BC濃度也明顯高于敏感患者，表明BC在耐藥患者體內也能夠被有效地吸收，并能夠被有效地從血漿轉運至腫瘤組織，在腫瘤組織中維持較高的藥物含量。本研究顯示腫瘤細胞自身對藥物BC產生的抵抗可能是導致耐藥型垂體泌乳素腺瘤患者經藥物BC治療

5、無效的原因。
　　2.溴隱亭耐藥垂體泌乳素腺瘤的血漿代謝組學研究
　　采用正、負離子檢測模式相結合的LC-MS/MS分析方法，對BC耐藥型和敏感型垂體泌乳素腺瘤患者的血漿樣本進行了代謝組學分析。最終在耐藥患者和敏感患者的血漿中發(fā)現(xiàn)了64個具有顯著性差異的代謝物，即潛在耐藥標志物。進一步通過高分辨率MS譜及MS/MS譜分析，結合同位素豐度比、氮規(guī)則，以及網絡數(shù)據(jù)庫檢索和標準品對比等分析手段與步驟對這些潛在耐藥標志物的結構進行了

6、分析鑒定。目前，共鑒定出21個潛在耐藥標志物的結構，包括氨基酸、鞘脂、脂肪酸類等代謝物，其中1-磷酸二氫鞘氨醇、C16鞘氨醇、1-脫氧C14二氫鞘氨醇等9個潛在耐藥標志物具有較高的診斷準確性(AUC＞0.9)。進一步對這些潛在耐藥標志物進行了代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)與BC敏感型垂體泌乳素腺瘤患者相比，耐藥患者體內鞘脂類代謝，賴氨酸生物合成，氨酰tRNA生物合成，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，賴氨酸降解等多條代謝通路發(fā)生紊亂。
　　3.

7、溴隱亭耐藥垂體泌乳素腺瘤的細胞代謝組學研究
　　以大鼠垂體泌乳素腺瘤耐藥型GH3細胞及敏感型MMQ細胞為研究對象，開展了藥物BC耐藥垂體泌乳素腺瘤的細胞代謝組學研究。首先，在細胞樣品前處理的過程中，采用液氮冷凍法對細胞進行淬滅，并分別采用甲醇、甲醇、水對絀胞樣品進行3次提取。在此基礎上，對細胞數(shù)目和復溶溶劑進行了考察，最終確定細胞樣品中的細胞數(shù)目應≥5×106個，以80％甲醇水作為復溶溶劑，優(yōu)化了垂體泌乳素腺瘤細胞的代謝組學樣品前

8、處理方法。其次，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)對藥物BC作用不同時間后MMQ和GH3細胞培養(yǎng)基中的泌乳素(Prolactin，PRL)進行了檢測，考察了耐藥型GH3細胞經BC作用后PRL水平的變化，并比較分析了藥物BC對兩種細胞PRL分泌的抑制效果，為潛在耐藥標志物的篩選提供了依據(jù)。進一步采用與血漿代謝組學相同的分析方法，對未經藥物BC作用的MMQ和GH3細胞開展了代

9、謝組學分析，通過多變量統(tǒng)計分析和相關性分析，發(fā)現(xiàn)了60個與耐藥相關的潛在生物標志物，并鑒定出24個潛在耐藥標志物的結構，其中包括膽堿、氨基酸、肉堿、核苷類等代謝物。代謝通路分析表明，與BC敏感型垂體泌乳素腺瘤細胞相比，耐藥腫瘤細胞中甘油磷脂代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，磷酸肌醇代謝，谷胱甘肽代謝等多條代謝通路發(fā)生紊亂。其中，甘油磷脂代謝，泛酸酯和輔酶A生物合成，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，氨酰tRNA生物