1、粘細(xì)菌以群體運動、子實體發(fā)育及捕食等復(fù)雜的多細(xì)胞群體行為而著稱。自然環(huán)境中,粘細(xì)菌通過群體的運動和捕食行為來利用難降解底物或微生物細(xì)胞；當(dāng)營養(yǎng)貧瘠時,細(xì)胞通過群體運動聚集形成子實體結(jié)構(gòu)和抗逆性的粘孢子來抵抗不利的環(huán)境(Shimkets,1990)。與其復(fù)雜的多細(xì)胞群體行為相對應(yīng),粘細(xì)菌具有較其他細(xì)菌更為龐大的基因組和復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)(Zusman et al.,2007；Goldmanet al.,2006)。由于粘細(xì)菌的多細(xì)胞群體行為依

2、賴固體介質(zhì)表面,目前分離得到的粘細(xì)菌菌株絕大多數(shù)來自于各種土壤環(huán)境(Reichenbach,1999；Dawid,2000),少量水環(huán)境中分離發(fā)現(xiàn)的嗜鹽或耐鹽粘細(xì)菌來自近海。在系統(tǒng)發(fā)生和生活模式上,嗜鹽粘細(xì)菌屬于海洋生境的本地類群,而耐鹽粘細(xì)菌的形成則是土壤粘細(xì)菌向海洋環(huán)境適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果(Zhang et al.,2005)。Myxococcus fulvus Hw-1(ATCC BAA-855)是一株能夠耐受海水鹽濃度生長的菌株。在低

3、濃度海水培養(yǎng)條件下,HW-1具有與土壤粘球菌類似的生活模式;但是當(dāng)海水濃度增加到一定程度時,HW-1又具有完全不同于陸生粘球菌的生活模式:在營養(yǎng)貧瘠的固體培養(yǎng)條件下營養(yǎng)細(xì)胞可以直接轉(zhuǎn)化形成具有抗逆性的粘孢子(Zhang et al.,2005)。耐鹽粘細(xì)菌以其隨海水濃度而遷變的細(xì)胞行為特性成為我們對海洋粘細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)研究的有益模式菌株。
　　 作為單細(xì)胞生物,細(xì)菌通常被認(rèn)為以個體行為為主；然而在一些復(fù)雜的生存環(huán)境中,細(xì)菌也需要借

4、助一定的群體行為:如生物膜的形成,群體感應(yīng)現(xiàn)象和多細(xì)胞子實體形態(tài)的發(fā)生來抵抗不利環(huán)境。粘細(xì)菌以其復(fù)雜的多細(xì)胞群體行為特性而成為研究自然環(huán)境中菌株間的識別、協(xié)作和競爭的分子機(jī)制的有益模式菌株。研究者們發(fā)現(xiàn)在一個小的生態(tài)位內(nèi)不同的粘細(xì)菌菌株之間能夠自我識別。Smith和Dworkin(Smith and Dworkin,1994)將兩株分屬于不同種的粘球菌混合在一起進(jìn)行發(fā)育時發(fā)現(xiàn)兩株菌株可以各自形成自己的子實體,只是一株菌株會完全抑制另外一

5、株菌株孢子的形成。隨后Fiegna和Velicer(2005)進(jìn)一步利用分離自不同生境的九株粘球菌菌株對這一現(xiàn)象進(jìn)行了更為深入的驗證和分析。他們的研究結(jié)果表明多數(shù)菌株的兩兩混合會導(dǎo)致其中至少一株菌株的生孢能力的下降,隨后他們的研究還發(fā)現(xiàn)即使在營養(yǎng)擴(kuò)展階段,菌株之間也存在著一定的不相容性。將兩株不同的粘球菌菌株進(jìn)行臨近點接擴(kuò)展時,總會存在著明顯的擴(kuò)展邊界而無法擴(kuò)展融合,只有同一株菌株才能夠?qū)崿F(xiàn)完全的擴(kuò)展融合。這也就表明在粘球菌的適應(yīng)進(jìn)化中

6、不僅包含了由陸地到海洋的適應(yīng)進(jìn)化還包括了菌株在自然生境中借助于群體行為所展現(xiàn)出的識別、協(xié)作和競爭的進(jìn)化出現(xiàn)。
　　 粘細(xì)菌所展現(xiàn)出的這種對環(huán)境的適應(yīng)行為引起了我們極大的研究興趣,因此本論文從兩個方面對粘球菌及其細(xì)胞群體行為環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)制展開研究:
　　 (1)以海洋耐鹽粘球菌Myxococcus fulvus HW-1為研究材料,對HW-1適應(yīng)海洋陸地兩種生存環(huán)境變換的分子機(jī)制進(jìn)行了探究。首先利用隨機(jī)轉(zhuǎn)座質(zhì)粒對HW-

7、1野生菌株進(jìn)行隨機(jī)突變,進(jìn)而篩選與鹽離子耐受及多細(xì)胞行為維持相關(guān)的基因。我們對實驗中獲得的300多株突變株進(jìn)行篩選得到了兩株耐鹽能力顯著下降的突變株,并對其中一株突變株YLH0401中發(fā)生插入失活的基因進(jìn)行了定位確認(rèn)及功能分析。該突變株在液體培養(yǎng)基中分散生長,耐鹽能力顯著下降,群體運動能力下降,子實體發(fā)育和生孢能力幾乎喪失。隨后的研究進(jìn)一步揭示出YLH0401中基因的失活可能引起HW-1菌株的胞外基質(zhì)的顯著減少,從而導(dǎo)致了菌株多細(xì)胞群體

8、行為的丟失或減弱。生物信息學(xué)及對失活基因存在的廣泛性分析則發(fā)現(xiàn),該失活基因是通過水平轉(zhuǎn)移而來的外源基因,其在多株耐鹽菌株中存在且具有一定的保守性,而在陸生的模式菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株中則不存在。鑒于該基因在高耐鹽菌株中存在的特異性及其在HW-1多細(xì)胞行為及耐鹽能力維持中的重要作用,我們推測該基因可能是海洋粘細(xì)菌為了更好地適應(yīng)海洋環(huán)境而獲取的外源基因。該基因的發(fā)現(xiàn)表明在陸地粘細(xì)菌向海洋進(jìn)化的過程中其可能借助于水平轉(zhuǎn)移獲得的外源基因來更好的增強(qiáng)和維

9、系多細(xì)胞行為以對抗海洋生境帶來的生存壓力。
　　 其次在前期本課題組利用微陣列技術(shù)分析了與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)答適應(yīng)相關(guān)的來自HW-1基因組的雙組分系統(tǒng)相關(guān)基因在淡水和海水表達(dá)條件下的差異。承接上述研究結(jié)果,本論文進(jìn)一步分析了在淡水和海水條件下顯著差異表達(dá)基因的基本功能及其在HW-1環(huán)境適應(yīng)中的作用。對這些顯著差異表達(dá)基因在HW-1和模式菌株DK1622中的同源性進(jìn)行了比對分析,發(fā)現(xiàn)這些基因在HW-1和DK1622中具有很高的同源性,這

10、暗示著功能的相似性。在此基礎(chǔ)上利用基因敲除的方法,我們成功地在模式菌株DK1622中獲得了23個基因缺失的突變株。首先對獲得的海水條件下最為顯著差異表達(dá)的兩個基因的功能進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)HW-1中海水條件下最為顯著上調(diào)表達(dá)基因的同源基因MXAN4042在DK1622中的缺失不僅導(dǎo)致了菌株耐受鹽離子能力的降低,而且還導(dǎo)致了菌株在含有海水離子情況下生孢能力的極大減弱；而HW-1中海水條件下最為顯著下調(diào)表達(dá)基因的同源基因MXAN3106在D

11、K1622中的缺失不但極大地提高了菌株的耐鹽生長能力,而且同時極大地提高了菌株的耐鹽生孢能力。這兩個基因的失活所引起的陸生粘球菌在海水條件下適應(yīng)性行為變化暗示著這兩個基因在HW-1適應(yīng)海洋環(huán)境中具有重要的作用。隨后我們又對剩余的21株突變株的耐鹽生長能力及淡海水條件下子實體發(fā)育行為和生孢能力進(jìn)行了分析。我們發(fā)現(xiàn)在這21個基因中有10個基因是參與粘球菌適應(yīng)海水鹽濃度的調(diào)控的,這進(jìn)一步證實了雙組分系統(tǒng)相關(guān)基因在細(xì)胞環(huán)境適應(yīng)調(diào)控中的重要作用。

12、綜合前期的微陣列實驗結(jié)果和對這23個顯著差異表達(dá)的基因及其功能的分析結(jié)果,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HW-1可能是依賴于在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)變化來適應(yīng)海洋和陸地環(huán)境的變換,而很顯然這種調(diào)控方式是快速而簡捷的。
　　 借助于微陣列技術(shù)可以批量篩選和分析與海水適應(yīng)相關(guān)的基因,進(jìn)而克服了由于HW-1遺傳體系的不完善和較低的轉(zhuǎn)座效率帶來的研究障礙；而隨機(jī)突變篩選還有可能獲得一些HW-1的基因組中的特有基因,為我們分析基因組擴(kuò)展與環(huán)境適應(yīng)的

13、關(guān)系提供一定的依據(jù)。綜合以上兩方面的實驗結(jié)果,我們推測海洋耐鹽粘細(xì)菌在適應(yīng)海洋環(huán)境的進(jìn)化過程中除了通過在轉(zhuǎn)錄水平上快速地調(diào)控基因的表達(dá)來適應(yīng)海陸環(huán)境的變換之外,還借助于水平轉(zhuǎn)移而來的外源基因來更好地增強(qiáng)和維系多細(xì)胞行為以對抗海洋環(huán)境所帶來的生存壓力。
　　 (Ⅱ)群體運動即S運動在粘球菌的多細(xì)胞群體行為維系中發(fā)揮著重要作用。s運動的主要胞外器官Tfp是由pilA基因編碼蛋白單體pilin組裝形成的。早在2002年Velicer等

14、人在研究中發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過人工進(jìn)化而導(dǎo)致S運動丟失的粘球菌菌株中,多數(shù)是因為pili基因簇中的基因發(fā)生突變導(dǎo)致的(Velicer and Stredwick,2002)。隨后的研究中我們發(fā)現(xiàn)pilA基因的序列組成具有典型性即包含了高度保守的N端編碼序列和高度可變的C端編碼序列。這也就揭示著在粘細(xì)菌多細(xì)胞行為進(jìn)化適應(yīng)的過程中pilA基因序列可能是多樣性進(jìn)化的。粘球菌群體運動主要胞外器官pili的多樣化進(jìn)化產(chǎn)生與自然環(huán)境中粘細(xì)菌菌株所展現(xiàn)出的不相

15、容性(自我識別現(xiàn)象)可能具有一定的相關(guān)性。因此在本部分實驗中我們以pilin單體的編碼基因pilA基因為著眼點,首先對自然環(huán)境中粘球菌菌株pilA基因序列的多樣性進(jìn)行了分析,然后比較分析了這些pilA基因的功能。綜合多種PCR方法最終我們成功獲得了59株粘球菌的pilA基因序列。經(jīng)過同源比對分析將這59個序列分為13類同源性較低的序列,但是每一類中的序列又是高度同源的。這些序列表現(xiàn)出的聚類性在一定程度上也反應(yīng)了菌株之間在進(jìn)化地位上的相關(guān)

16、性。隨后我們成功的構(gòu)建了八株包含有不同pilA基因的回補菌株,并分析了回補菌株中pilA基因?qū)K10410的多細(xì)胞群體運動能力的恢復(fù)情況。結(jié)果表明八個pilA基因均能夠回復(fù)DK10410的多細(xì)胞群體運動,從回補菌株的EPS產(chǎn)生能力上來看,這些外源的pilA基因均能夠誘導(dǎo)EPS產(chǎn)生從而恢復(fù)s運動。本文分析結(jié)果為pili參與多糖產(chǎn)生調(diào)控途徑提供了又一有力的實驗證據(jù),同時也表明自然環(huán)境中粘球菌的群體運動行為機(jī)制與模式菌株的運動機(jī)制是極為類似

17、的。
　　 在此基礎(chǔ)上借助于回補菌株我們又進(jìn)一步探討了pili在粘球菌的自我識別過程中的作用,期望可以初步闡明自然環(huán)境中粘球菌自我識別的機(jī)制。首先分析了pili在粘球菌菌株擴(kuò)展邊界出現(xiàn)中發(fā)揮的作用,實驗結(jié)果表明pili在粘球菌菌株的這種自我識別中發(fā)揮著一定的作用。但是這種識別并不是完全受pili主導(dǎo)的,可能還有其他的胞外組分發(fā)揮著一定的作用。其次利用菌株的兩兩混合發(fā)育分析了pili在菌株發(fā)育階段自我識別中的作用。當(dāng)DK1622與