1、研究背景：
　　肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，死亡率排第五，并且具有高耐藥性和缺乏有效的治療方法。盡管過去的幾十年出現(xiàn)很多先進的治療方法但還是有很多人死于肝癌。外科手術是非常有效的治療方法，但很多的患者診斷時已失去了手術機會。全身性化療是晚期肝癌患者的主要治療方法，但不論是單藥還是多藥聯(lián)合治療效果均不理想。傳統(tǒng)的治療方法似乎已經(jīng)達到了平臺期。因此，如何提高HCC

2、治療效果是當今腫瘤研究的熱點。目前臨床腫瘤免疫治療取得一系列突破，明確藥物相關免疫作用及機制，為其更好地應用于臨床提供有力依據(jù)，最終達到提高治療效果，延長患者生存期的作用，具有很重要的意義。
　　腫瘤微環(huán)境（tumor microenviroment）通常是由多種不同細胞構成，主要包括腫瘤細胞、間質細胞、免疫細胞（如樹突狀細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞等）組成，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移有著密切聯(lián)系。免疫細胞在體內環(huán)境中起著至關重要的

3、作用，通過免疫監(jiān)視，免疫清除維持機體的正常穩(wěn)定。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細胞會影響微環(huán)境的功能從而引起免疫抑制狀態(tài)以應對惡劣的生存條件，維持自身生存。
　　巨噬細胞是一種調節(jié)性很強的細胞，在維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，維持機體免疫狀態(tài)等方面具有重要作用。多種研究表明，巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分之一，且腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞在多種因素的作用下常常會發(fā)生表型變化，轉變?yōu)槟[瘤相關巨噬細胞（tumor-associated mac

4、rophage，TAM），TAM的功能會發(fā)生改變，可以引起微環(huán)境中免疫狀態(tài)的改變，進而發(fā)揮促進腫瘤增殖、侵襲遷移等促腫瘤作用。然而，腫瘤細胞通過何種途徑使原來具有抗腫瘤免疫調節(jié)作用的巨噬細胞轉變?yōu)槊庖咭种频木奘杉毎麖亩龠M腫瘤發(fā)展，能否通過褪黑素影響該途徑從而減輕這種腫瘤導致的免疫抑制機制尚不清楚。Exosome是一類直徑大約為30-100nm的圓形或類圓形囊泡樣結構，其包含有大量物質，在細胞間信號傳遞中發(fā)揮重要作用。因此，深入研究微環(huán)

5、境中的腫瘤細胞影響巨噬細胞，進而改變其免疫功能具有重要的臨床意義。本課題擬探討褪黑素誘導的肝癌細胞外泌體能否影響巨噬細胞的免疫功能及可能的分子機制。
　　目的：
　　通過將處于褪黑素誘導與未誘導的肝癌細胞釋放的exosome與巨噬細胞共培養(yǎng)，觀察巨噬細胞PD-L1(程序性死亡配體)及炎癥因子的表達狀況，了解褪黑素作用的肝癌細胞對巨噬細胞免疫功能的影響。并通過研究相關的 STAT3信號通路，進一步研究褪黑素誘導的肝癌exoso

6、me調控巨噬細胞PD-L1表達的具體機制。
　　方法：
　　(1)使用0.1mM的褪黑素與肝癌細胞共培養(yǎng)24小時，分別收集 MT處理組（Exo-MT）和未處理組細胞（Exo-con）的上清液，使用ExoQuick-TC試劑盒提取 exosome，透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope,TEM）觀察exosome的形態(tài)、大小，Western-Blot方法檢測exosomes標志蛋白CD

7、63、TSG101以及分子伴侶蛋白Calnexin的表達。
　　(2)使用膜染料PKH67標記exosome，然后將PKH67標記的exosomes與巨噬細胞共同孵育或尾靜脈注射到裸鼠體內，12h后共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞吞噬exosome的情況。
　　(3)將不同的exosome（Exo-con和Exo-MT）與THP-1巨噬細胞（經(jīng)100ng/ml PMA誘導48小時所得）共培養(yǎng)24小時，分別收集細胞和上清液，使用流式細

8、胞儀檢測PD-L1表達，CBA細胞因子試劑盒檢測炎癥因子表達。
　　(4)分別對裸鼠尾靜脈注射100μl的PBS、Exo-con和Exo-MT，隔日一次，共10次。注射結束后24h，處死裸鼠收集腹腔巨噬細胞，貼壁2小時后換液棄去未貼壁細胞，剩余細胞培養(yǎng)過夜后收集細胞和上清液，流式細胞儀檢測 PD-L1和炎癥因子的表達。
　　(5)分別收集Exo-con和Exo-MT與THP-1巨噬細胞共培養(yǎng)24小時后的細胞，提取總蛋白，We

9、stern-Blot方法檢測STAT3與p-STAT3等蛋白水平變化。
　　(6)使用STAT3抑制劑抑制巨噬細胞STAT3表達，Western-Blot方法檢測STAT3通路蛋白變化，流式細胞術檢測抑制后THP-1巨噬細胞PD-L1表達變化。
　　結果：
　　(1)透射電鏡可見收集到的外泌體呈圓形或類圓形膜性囊泡樣結構，直徑為30-100nm，符合外泌體的典型特征。Western-Blot檢測顯示所得的“exosom

10、e”表達CD63，但不表達內質網(wǎng)分子伴侶蛋白Calnexin，進一步證明上清中收集到的是不含細胞成分的外泌體。BCA蛋白定量法對所得外泌體總蛋白進行定量，結果表明MT作用24h后肝癌細胞分泌的外泌體無明顯增加。
　　(2)激光共聚焦顯微鏡顯示，PKH67標記的外泌體能夠被 THP-1巨噬細胞和腹腔巨噬細胞所攝取，流式細胞術結果進一步證明腹腔巨噬細胞能夠攝取 PKH67標記的外泌體。
　　(3)流式細胞術和免疫組化結果均顯示，

11、與對照組和 Exo-con組相比，Exo-MT可明顯下調THP-1巨噬細胞PD-L1。CBA炎癥因子檢測結果顯示，Exo-con可上調IL-1β，IL-6，IL-10和TNF-α等炎癥因子的表達，Exo-TM則可以下調這些細胞因子的表達。類似的，將Exo-con和Exo-MT通過尾靜脈注射到裸鼠體內，Exo-con注射小鼠的腹腔巨噬細胞PD-L1表達也明顯上升，且細胞上清中的IL-6，IL-10和TNF-α等炎癥因子的表達明顯升高,而E

12、xo-MT組則明顯下降。
　　(4) Western-Blot檢測顯示Exo-MT與THP-1巨噬細胞共培養(yǎng)24小時后能顯著下調p-STAT3蛋白水平。而Exo-con則明顯上調了p-STAT3蛋白的表達。提示外泌體可能是通過STAT3信號通路調節(jié)PD-L1的表達。
　　(5)使用STAT3抑制劑使THP-1巨噬細胞STAT3蛋白明顯下調，流式細胞術檢測結果顯示，抑制劑能夠明顯降低Exo-con作用下THP-1巨噬細胞的PD