1、背景:
　　腎移植已成為終末期腎衰竭有效的臨床治療手段,為移植患者制定有效合理的抗排異免疫抑制方案,對其長期存活率和存活質(zhì)量有著至關(guān)重要的作用。環(huán)孢素A(Cyclosporine A, CsA)是器官移植受者普遍應(yīng)用的免疫抑制劑之一,在臨床實踐中,我們發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿即鹽酸黃連素(Berberine chloride, BBR)可顯著增加腎移植受者CsA的全血濃度,較大幅度的減少CsA劑量,有望成為節(jié)省CsA昂貴費用的手段。圍繞這一

2、全新的發(fā)現(xiàn),本課題組已進行了人體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗:即在腎移植受者和健康受試者中進行CsA藥代動力學(xué)的研究,驗證了BBR對CsA的增效作用,且不增加CsA的肝腎毒性;動物實驗:BBR及其與 CsA合用對大鼠(小鼠)的肝臟(小腸)微粒體酶活性以及 CYP3A1、CYP3A2、CYP2E1、CYP1A1及MDR1a和MDR1b基因影響的研究,結(jié)果均提示BBR可能通過抑制大鼠(小鼠)肝臟或/和小腸的CYP3A和P-gp的活性或/和表達而增加Cs

3、A的生物利用度,間接證明了BBR對CYP3A和P-gp的影響。但BBR對CYP3A和P-gp調(diào)控的分子機制仍不清楚,如能通過本研究初步闡明,將有利于最終證實黃連素對CsA的免疫抑制增效作用的確切機制,為黃連素作為免疫抑制增效劑在臨床的廣泛應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　目的:
　　本課題旨在通過大鼠體內(nèi)試驗,進一步確證黃連素對CYP3A和P-gp的影響;以人肝癌細胞株HepG2細胞為對象研究BBR對CYP3A4和P-gp mRNA水

4、平和蛋白表達的影響;以HepG2細胞為對象研究BBR對CYP3A4和P-gp的上游調(diào)控基因PXR和RXR mRNA水平表達的影響,初步探討B(tài)BR對CYP3A4或P-gp的調(diào)控是否通過PXR信號通路;為BBR作為CsA的免疫抑制增效劑在臨床的廣泛應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、BBR對大鼠體內(nèi)咪達唑侖及其代謝物1ˊ-羥基咪達唑侖的藥代動力學(xué)影響實驗。以咪達唑侖作為CYP3A的探針?biāo)幬?建立大鼠血漿中咪達唑侖和1ˊ-羥基

5、咪達唑侖的HPLC分析檢測方法,HPLC法測定各不同給藥組大鼠血漿藥物濃度,分析比較各給藥組BBR對大鼠體內(nèi)咪達唑侖及其代謝物的藥代動力學(xué)參數(shù)的影響。
　　2、BBR對大鼠體內(nèi)羅丹明123藥代動力學(xué)影響實驗。以羅丹明123作為P-gp的探針?biāo)幬?建立大鼠血漿中羅丹明123 HPLC分析檢測方法,HPLC法測定各不同給藥組大鼠血漿藥物濃度,分析比較各給藥組BBR對大鼠體內(nèi)羅丹明123代謝的藥代動力學(xué)參數(shù)的影響。
　　3、BBR

6、對HepG2細胞的毒性實驗。采用MTT法檢測不同濃度的BBR(1-100μg/mL)對HepG2細胞活力的影響,并在BBR對HepG2細胞毒性較小的濃度范圍進行實驗。
　　4、BBR對HepG2細胞CYP3A4和P-gp蛋白表達影響實驗。實驗分為空白對照組、不同濃度BBR組、誘導(dǎo)劑利福平(Rif)組以及各不同濃度BBR和Rif共同給藥組,與對數(shù)期HepG2細胞孵育48h后,提取細胞總蛋白,Western blotting法檢測CY

7、P3A4、P-gp在蛋白水平的表達?？疾觳煌瑵舛鹊腂BR對HepG2細胞CYP3A4和P-gp蛋白表達水平影響。
　　5、BBR對HepG2細胞CYP3A4、MDR1 mRNA以及上游調(diào)控基因PXR、RXR mRNA表達的影響實驗。根據(jù)BBR對HepG2細胞CYP3A4和P-gp蛋白表達影響的實驗結(jié)果,選取BBR對CYP3A4和P-gp蛋白表達有抑制作用的BBR濃度范圍進行實驗。實驗分為空白對照組、BBR低、中、高劑量組、誘導(dǎo)劑利

8、福平(Rif)組以及各濃度BBR和Rif共同給藥組,與對數(shù)期HepG2細胞孵育48h后,提取 RNA,采用實時熒光定量 PCR法( Real-time quantitative PCR,RTQ-PCR)檢測CYP3A4、MDR1、PXR、RXR mRNA的表達水平,分析考察CYP3A4、MDR1 mRNA的表達與上游調(diào)控基因PXR、RXR mRNA表達水平的關(guān)聯(lián)性。
　　6、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s

9、)表示,采用DAS2.0藥代動力學(xué)軟件分析各組大鼠血藥濃度隨時間的變化,計算其藥代動力學(xué)參數(shù),采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析,組間差異采用t檢驗,統(tǒng)計結(jié)果以P>0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01表示顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　1、建立的大鼠血漿中咪達唑侖及其代謝產(chǎn)物1ˊ-羥基咪達唑侖測定的HPLC檢測方法,完全符合咪達唑侖及其代謝產(chǎn)物分析測試的要求;另外建立的大鼠血漿中羅丹明

10、123的HPLC檢測方法也完全能夠符合羅丹明123大鼠血漿樣本分析測試的要求,兩種檢測方法均具有較高的靈敏度和特異性;適用于本課題評價藥物間相互作用的研究,為本課題實施奠定了可靠基礎(chǔ)。
　　2、口服不同藥物后咪達唑侖的主要藥動學(xué)參數(shù)為:AUC(0-t)(μg/mL·h)分別為:(1.25±0.29)(陰性對照組)、(1.69±0.31)( BBR50mg/kg)、(2.03±0.44)( BBR100mg/kg)、(2.12±0.

11、66)( BBR200mg/kg)、(2.47±0.49)(酮康唑75mg/kg);Cmax(μg/mL)分別為(1.13±0.25)(陰性對照組)、(1.69±0.23)( BBR50mg/kg)、(1.84±0.29)( BBR100mg/kg)、(2.12±0.53)(BBR200mg/kg)、(2.21±0.29)(酮康唑75mg/kg)。1ˊ-羥基咪達唑侖的主要藥動學(xué)參數(shù)如下:AUC(0-t)(μg/mL·h)分別為:(0.6

12、6±0.28)(陰性對照組)、(0.46±0.19)( BBR50mg/kg)、(0.42±0.11)( BBR100mg/kg)、(0.36±0.09)( BBR200mg/kg)、(0.37±0.10)(酮康唑75mg/kg);Cmax(μg/mL)分別為(0.51±0.16)(陰性對照組)、(0.44±0.13)( BBR50mg/kg)、(0.40±0.08)( BBR100mg/kg)、(0.32±0.07)( BBR200m

13、g/kg)、(0.33±0.09)(酮康唑75mg/kg)。用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析,(BBR50、100、200mg/kg)和(酮康唑75mg/kg)均能夠顯著升高MDZ的AUC(0-t)、AUMC(0-t)、Cmax(P<0.05),且呈劑量依賴性。(BBR100、200mg/kg)和(酮康唑75mg/kg)能夠顯著降低1ˊ-OH-MDZ的AUC(0-t)、AUMC(0-t)、Cmax(P<0.05)且呈劑量依賴性,但(BBR

14、50mg/kg)對1ˊ-羥基咪達唑侖的藥動學(xué)參數(shù)的影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　3、口服不同藥物后羅丹明123的主要藥動學(xué)參數(shù)為:AUC(0-t)(μg/L·h)分別為:(48.36±6.4)(陰性對照組)、(59.58±13.37)( BBR50mg/kg)、(77.51±6.84)( BBR100mg/kg)、(95.49±15.99)( BBR200mg/kg)、(93.01±13.07)(維拉帕米4mg/kg);

15、Cmax(μg/L)分別為(4.41±0.45)(陰性對照組)、(10.18±5.59)( BBR50mg/kg)、(11.78±3.19)( BBR100mg/kg)、(16.25±8.65)(BBR200mg/kg)、(11.39±2.76)(維拉帕米4mg/kg)。統(tǒng)計分析:(BBR100、200mg/kg)和(維拉帕米4mg/kg)均能夠顯著升高羅丹明123的AUC(0-t)(P<0.01);(BBR50、100、200mg/k

16、g)和(維拉帕米4mg/kg)均能夠顯著升高羅丹明123的Cmax(P<0.05)且呈劑量依賴性。
　　4、BBR在1-40μg/mL濃度范圍內(nèi)對HepG2細胞毒性小,細胞活力大于80％,超過40μg/mL時對細胞毒性大,細胞存活率低,以此濃度范圍作為本實驗的給藥濃度更為合理。
　　5、Western blotting結(jié)果表明:與空白對照組比較,0.1、0.5和2μg/mL BBR組可使CYP3A4和 P-gp蛋白表達增加(

17、P<0.05),且呈劑量依賴性,但10、40μg/mL BBR組卻使CYP3A4和P-gp蛋白表達顯著降低(P<0.01);與空白對照組比較,Rif誘導(dǎo)了CYP3A4和P-gp蛋白表達(P<0.05),同樣與Rif組比較10μg/mL BBR+10μM Rif、40μg/mL BBR+10μM Rif組明顯的逆轉(zhuǎn)了 Rif對CYP3A4和P-gp蛋白表達的誘導(dǎo)作用,顯著降低了CYP3A4和P-gp蛋白的表達(P<0.01)。
　　

18、6、RTQ-PCR結(jié)果表明:與空白對照組比較10μg/mL BBR抑制了CYP3A4 mRNA的表達(P<0.05),隨著 BBR濃度的增加20、40μg/mL則更強地抑制CYP3A4 mRNA的表達(P<0.01),與空白對照組比較10、20、40μg/mL BBR均能顯著降低MDR1 mRNA的表達(P<0.01),并且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性;同時與空白對照組比較Rif誘導(dǎo)了CYP3A4、MDR1、PXR、RXR mRNA的表達

19、(P<0.01);與Rif組比較10μg/mL BBR+10μM Rif、20μg/mL BBR+10μM Rif、40μg/mL BBR+10μM Rif組中BBR顯著抑制了Rif對CYP3A4、MDR1、PXR、RXR mRNA的誘導(dǎo)作用(P<0.05),隨著BBR濃度的增加抑制作用也越強。
　　結(jié)論:
　　本文首先從動物體內(nèi)水平探明BBR對CYP3A和P-gp的影響,其后從細胞分子生物學(xué)水平探索BBR通過PXR信號通路

20、對CYP3A4和P-gp的調(diào)控機制。
　　1、結(jié)果提示, BBR可以顯著抑制咪達唑侖的代謝,該抑制作用可能是BBR抑制了咪達唑侖的代謝酶CYP3A的活性所致。同時BBR也可以顯著抑制羅丹明123的代謝,該抑制作用也可能是BBR抑制了羅丹明123的轉(zhuǎn)運體P-gp的活性所致。因此臨床上可以把BBR作為提高CsA血藥濃度的增效劑使用,減少CsA的給藥劑量。
　　2、結(jié)果提示,BBR對HepG2細胞CYP3A4和P-gp的蛋白表達有