1、目的:通過建立支氣管哮喘模型，運用分子生物學技術檢測哮喘小鼠和人胚肺成纖維細胞中易感基因ADAM33、MMPs/TIMPs及轉(zhuǎn)錄因子ETS-1的表達，以及固本防哮飲干預后上述指標的變化，從氣道重塑的角度，研究固本防哮飲防治兒童支氣管哮喘的作用機制。
　　方法:
　　體內(nèi)實驗研究:用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)致敏和激發(fā)聯(lián)合呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染的方法，建

2、立BALB/c小鼠哮喘模型，采用不同劑量的固本防哮飲和孟魯司特鈉進行干預。采集小鼠血清、肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid，BALF)和肺組織。采用蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HEstaining)、過碘酸雪夫染色(Periodic Acid-Schiff staining，PAS staining)、馬松三色染色(Masson's trichrome stai

3、ning)觀察小鼠肺組織炎癥、黏液分泌和膠原沉積等情況。ELISA技術檢測各組小鼠血清中IgE的水平、BALF中IL-12、TGF-β1的水平以及肺組織中IL-1β的水平。real-time RT-PCR技術檢測各組小鼠肺組織中IL-6、IL-13、TGF-β1、IL-1β、ADAM33、ETS-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達情況。Western Blot技術檢測各組小鼠肺組織中ADAM33、ET

4、S-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白表達情況。Envision法免疫組織化學技術檢測各組小鼠肺組織中ADAM33、ETS-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白分布及表達情況。
　　體外實驗研究:制各固本防哮飲含藥血清，用Th2型細胞因子IL-4刺激人胚肺成纖維細胞(HFLFs)，MTT法檢測IL-4對HFLFs細胞增殖的影響及固本防哮飲含藥血清對HFLFs細胞增殖的作用。IL-4刺激

5、HFLFs細胞24 h后，采用固本防哮飲和孟魯司特鈉含藥血清進行干預，24 h后收集細胞。real-time RT-PCR技術檢測各組HFLFs細胞中ADAM33、ETS-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達;Western Blot技術檢測各組HFLFs細胞中ADAM33、ETS-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達;免疫熒光技術檢測ADAM33、ETS-1、MMP-2、M

6、MP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白在HFLFs細胞的定位及相對表達。
　　結(jié)果:
　　1.固本防哮飲對哮喘小鼠肺部炎癥、氣道黏液分泌及膠原沉積的影響
　　與正常組比較，模型組小鼠肺部病變明顯，支氣管腔及伴行的血管周圍有以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，肺泡上皮細胞脫落，平滑肌厚度增加，纖維結(jié)締組織增生。氣道上皮可見杯狀細胞增生，黏液過度分泌，膠原纖維顯著增加，甚至有小血管形成。固本防哮飲不同劑量組及孟魯司特鈉組小鼠肺

7、部炎癥減輕，杯狀細胞增生和黏液分泌減少，膠原纖維也減少。孟魯司特鈉組與固本防哮飲不同劑量組之間無差異。
　　2.固本防哮飲含藥血清對HFLFs細胞增殖的影響
　　IL-4對HFLFs的增殖有促進作用，在一定的范圍內(nèi)呈濃度依賴性。固本防哮飲或孟魯司特鈉含藥血清對HFLFs細胞的增殖有抑制作用，從5％～20％呈濃度依賴性。
　　3.固本防哮飲對哮喘易感基因ADAM33的影響
　　模型組小鼠肺組織中ADAM33 mRN

8、A和蛋白的表達量顯著高于正常組，與模型組相比，固本防哮飲不同劑量組及孟魯司特鈉組小鼠肺組織中ADAM33 mRNA和蛋白的表達量均明顯下降。ADAM33蛋白主要分布于支氣管管壁。
　　IL-4作用后，模型組HFLFs細胞中ADAM33 mRNA和蛋白的表達量顯著升高，固本防哮飲組和孟魯司特鈉組HFLFs細胞中ADAM33 mRNA和蛋白的的表達降低，固本防效飲對ADAM33蛋白的下調(diào)作用不明顯。ADAM33蛋白主要在HFLFs細胞

9、中細胞膜和細胞質(zhì)中表達。
　　4.固本防哮飲對轉(zhuǎn)錄因子ETS-1的影響
　　模型組小鼠肺組織中ETS-1 mRNA和蛋白的表達量顯著高于正常組，與模型組相比，固本防哮飲不同劑量組及孟魯司特鈉組小鼠肺組織中ETS-1 mRNA和蛋白的表達量均明顯下降。ETS-1蛋白主要分布于支氣管管壁。
　　IL-4作用后，模型組HFLFs細胞中ETS-1 mRNA和蛋白的表達量顯著升高，固本防哮飲組和孟魯司特鈉組HFLFs細胞中ETS

10、-1 mRNA和蛋白的的表達降低。ETS-1蛋白主要在HFLFs細胞中細胞膜和細胞質(zhì)中表達。
　　5.固本防哮飲對MMPs/TIMPs的影響
　　模型組小鼠肺組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1 mRNA和蛋白的表達量顯著高于正常組;與模型組相比，孟魯司特鈉組及固本防哮飲不同劑量組小鼠肺組織中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白的表達量均明顯下降，其中固本防哮飲高劑量組TIM

11、P-2蛋白的下降不明顯。MMP-2、TIMP-2和TIMP-1蛋白主要分布于支氣管管壁，而MMP-9蛋白分布于廣泛肺組織。
　　與正常組比較，模型組小鼠肺組織MMP-2/TIMP-2在mRNA水平明顯降低，與模型組相比，孟魯司特鈉組MMP-2/TIMP-2降低，固本防哮飲不同劑量組種MMP-2/TIMP-2升高。與正常組比較，模型組小鼠肺組織中MMP-9/TIMP-1在mRNA水平明顯降低，與模型組相比，孟魯司特鈉、固本防哮飲中劑

12、量組及高劑量組中MMP-9/TIMP-1升高，固本防哮飲低劑量及預防組無差異。
　　IL-4刺激后，HFLFs細胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA和蛋白的表達較正常組升高，固本防哮飲組和孟魯司特鈉組HFLFs細胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA和蛋白的表達降低，其中孟魯司特鈉對TIMP-2 mRNA的下調(diào)作用不明顯。MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白主

13、要表達于HFLFs細胞的細胞膜和細胞質(zhì)。
　　IL-4刺激后，在mRNA水平上，HFLFs細胞中MMP-9/TIMP-1和MMP-2/TIMP-2升高;孟魯司特鈉組和固本防哮飲組中MMP-9/TIMP-1和MMP-2/TIMP-2降低。
　　6.固本防哮飲對哮喘相關細胞因子的影響
　　與正常組比較，模型組小鼠血清中總IgE、BALF中TGF-β1及肺組織中IL-1β的平均濃度顯著升高;與模型組相比，孟魯司特鈉組及固本防

14、哮飲不同劑量組小鼠總IgE、TGF-β1、IL-1β的平均濃度均明顯下降。模型組小鼠BALF中IL-12平均濃度顯著低于正常組，與模型組比較，孟魯司特鈉組小鼠BALF中IL-12的平均濃度顯著升高，固本防哮飲各劑量組的IL-12平均濃度高于模型組，低于孟魯司特鈉組，但無差異。OVA致敏激發(fā)和RSV感染后，模型組小鼠肺組織中IL-6、IL-13、IL-1β、TGF-β1 mRNA的表達量顯著高于正常組，與模型組相比，孟魯司特鈉組及固本防哮

15、飲不同劑量組小鼠肺組織中IL-6、IL-13、IL-1β、TGF-β1 mRNA的表達量均明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1.固本防哮飲能明顯減輕哮喘小鼠肺部炎癥，減少肺泡上皮細胞脫落，減輕纖維結(jié)締組織增生，減少杯狀細胞增生和分泌黏液，減少膠原在網(wǎng)狀基底膜的沉積。
　　2.OVA致敏激發(fā)和RSV的感染能誘導哮喘易感基因ADAM33的表達，IL-4也能誘導ADAM33的表達，固本防哮飲能降低ADAM33的表達，降低機體對哮喘

16、的易感性，這可能是固本防哮飲改善患兒肺脾腎不足體質(zhì)狀態(tài)的機制之一。
　　3.OVA致敏激發(fā)和RSV感染、IL-4的刺激均能誘導轉(zhuǎn)錄因子ETS-1表達增加，促進MMP-2、MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄，MMP-2、MMP-9表達升高，會刺激內(nèi)源性抑制劑TIMP-2、TIMP-1的產(chǎn)生，引起MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1失衡，導致細胞外基質(zhì)的沉積和膠原纖維的增生，進而導致氣道修復與重塑。固本防哮飲能降低ETS-1對MMP2

17、、MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄，降低MMP2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表達，調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1平衡，減少促纖維化細胞因子TGF-β1的表達，從而維持ECM內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，減少杯狀細胞分泌黏液，減少膠原的沉積，延緩氣道重塑的進程。早期給予固本防哮飲，可預防氣道重塑的產(chǎn)生。這可能是固本防哮飲延長哮喘緩解天數(shù)，減少哮喘發(fā)作次數(shù)的作用機制之一。
　　4.OVA和RSV能促進B淋巴細胞產(chǎn)生IgE，還