1、漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，其作用底物非常廣泛，包括酚類、芳胺類、羧酸類、甾體激素和生物色素等。漆酶不僅在木質素的降解和制漿造紙中有重要的應用前景，而且在廢水處理、生物漂白、環(huán)境污染物降解、土壤修復、生物監(jiān)測、食品加工和有機合成等方面也具有潛在的應用價值。
　　 目前，自然環(huán)境中絕大部分的微生物不易獲得分離和培養(yǎng)，這極大限制了人們對微生物資源的有效利用。宏基因組學方法避開了傳統(tǒng)的微生物分離

2、培養(yǎng)方法，直接從環(huán)境樣品中提取總基因組DNA，通過構建和篩選宏基因組文庫來獲得新的功能基因或生物活性物質。宏基因組文庫包括了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物遺傳信息，因此增加了獲得新的功能基因和生物活性物質的機會。
　　 在論文中，我們從紅樹林環(huán)境樣品中提取總基因組，構建了一個的宏基因組文庫，并從中篩選獲得一個新的漆酶基因。采用大腸桿菌表達系統(tǒng)對該基因進行高效表達，并研究其重組蛋白的酶學性質和在降解環(huán)境污染物方面的應用，此外，為了進一步

3、提高該漆酶的酶活性及對環(huán)境污染物的降解能力，利用易錯PCR技術對該基因進行分子改造。主要研究結果如下：
　　 構建了近海紅樹林環(huán)境樣品的宏基因組文庫，通過功能篩選方法，成功篩選出一個其表達產物具有漆酶活性的新基因，命名為lac591。該基因序列全長1500bp，編碼500個氨基酸殘基，推測其分子量為57.4 kDa。通過蛋白序列分析發(fā)現，漆酶Lac591含有4個作為銅離子結合位點的組氨酸保守區(qū)域。同源性比對結果表明，該基因與細菌

4、漆酶有中等程度的同源性，最高的是與嗜堿芽孢桿菌(Bacillushalodurans C-125)的漆酶為52％。該基因已經提交到GenBank，登錄號為GQ468313。
　　 將篩選出的漆酶基因lac591連接到pET-32a(+)表達載體上，并轉入表達菌株Escherichia coli BL21(DE3)中，使用終濃度為1.0 mM IPTG及0.25 mM CuSO4，在30℃誘導8 h，目的蛋白表達量達到最高，為38

5、0 mg/L，是已知漆酶基因中的最高表達量。重組漆酶蛋白對多種常見底物的比酶活分別為12.73 U/mg(2，6-DMP)、5.43 U/mg(α-萘酚)、7.35 U/mg(鄰苯二酚)、1.02 U/mg(愈創(chuàng)木酚)、0.51U/mg(丁香醛連氮)，以及0.15 U/mg(ABTS)。SDS-PAGE電泳結果表明，純化后的重組蛋白的分子量約為75 kDa(其中18 kDa為表達載體上的融合蛋白標簽分子量)，結合Native-PAGE分

6、析結果，推斷該漆酶為單亞基蛋白。酶學性質研究顯示，純化后漆酶對多種研究底物的最適反應pH值分別為8.0(2，6-DMP)，8.2(α-萘酚)，9.0(鄰苯二酚)，7.5(愈創(chuàng)木酚)，8.0(丁香醛連氮)以及7.4(ABTS)；在pH7.0～10.0范圍內仍能保留大于80％的酶活(以愈創(chuàng)木酚為底物)，表明該酶為堿性漆酶；此外，該酶的最適反應溫度為55℃，且在50℃以下溫度處理30 min能保留70％以上的酶活性(以愈創(chuàng)木酚為底物)。不同的

7、金屬離子對漆酶活性有不同程度的影響，在1 mM低濃度條件下，Ca2+和Fe2+使酶活性分別提高到150％和140％，Mn2+、Mg2+、Co2+、Na+和K+對酶活性影響不明顯，Ni+、Zn2+和Al3+則使酶活性降低至77％、55％和68％；而在100 mM高濃度下，Ca2+使酶活性提高2倍，Mg2+、Na+和K+使酶活性分別提高到125％、120％和110％，Mn2+使酶活性降低至70％，Co2+、Zn2+、Fe2+、Ni+和Al3

8、+則使漆酶完全失活。1 mM EDTA能完全抑制重組漆酶Lac591的酶活性；1 mM的尿素和咪唑對酶活性的影響不明顯，但100 mM的尿素和咪唑則分別抑制酶活性至20％和46％；1 mM的SDS抑制酶活性至42％，100 mM的SDS則使漆酶完全失活。此外，該酶的動力學參數kcat/Km顯示，2，6-DMP為該酶的最適反應底物，其余底物依次為鄰苯二酚、α-萘酚、愈創(chuàng)木酚、丁香醛連氮和ABTS。
　　 在研究重組漆酶Lac591

9、對環(huán)境污染物的降解時發(fā)現，在金屬離子Ca2+和小分子介體ABTS(或HBT)存在的情況下，重組漆酶Lac591處理染料14 h后，其降解率分別為11％(堿性藍3)、25％(亞甲基藍)、57％(溴酚藍)、60％(結晶紫)、37％(亮藍R)和10％(酸性紫7)；而對靛紅染料，漆酶處理60 min其降解率即可達到100％。此外，在小分子介體ABTS(或HBT)存在的情況下，Lac591處理堿木質素14 h后，其降解率可達11％。結果表明，該漆

10、酶在降解環(huán)境污染物中具有一定的應用前景。
　　 由于我們所篩選出的漆酶Lac591存在比酶活性較低，因此我們進一步采用定向進化技術對該基因進行分子改造。通過三輪易錯PCR方法構建了隨機突變文庫，以愈創(chuàng)木酚底物酶活力為篩選指標，最終獲得酶活性提高的突變酶(Lac3T93)。經氨基酸序列比對，發(fā)現突變酶共有4個氨基酸發(fā)生了替換，突變點分別是E316V、F62L、V55A和N40S。與野生型漆酶相比較，突變酶的酶活性分別提高了4.1倍

11、(4.10 U/mg，以愈創(chuàng)木酚為底物)，和4.8倍(61.22 U/mg，以2，6-DMP為底物)。突變酶的最適反應溫度提高了5℃，達到60℃，其最適反應pH值從7.5提高到8.0(以愈創(chuàng)木酚為底物)，但突變酶的溫度和pH穩(wěn)定性未見明顯改善。此外，在相同條件下，突變酶Lac3T93對堿性藍3、亞甲基藍、溴酚藍和結晶紫等染料的降解率分別提高至26％、55％、79％和83％；并且對靛紅染料完全降解所需時間由60 min縮短到40 min;