1、本實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)部分:
　　第一部分 小鼠燒傷早期刺激反應(yīng)相關(guān)基因靶標(biāo)的篩選
　　目的：
　　利用生物信息學(xué)方法對(duì)小鼠燒傷早期免疫細(xì)胞差異基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，以期對(duì)小鼠燒傷后免疫細(xì)胞應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)過(guò)程的機(jī)制加以了解，為篩選出燒傷早期應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)相關(guān)治療靶標(biāo)。
　　方法：
　　1.基因芯片數(shù)據(jù)篩選:從NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.

2、nih.gov/geo/）進(jìn)行基因芯片樣本篩選，樣本需滿足以下篩選條件:①燒傷動(dòng)物模型，TBSA＞20％，Ⅲ度燒傷或燙傷;②燒傷或燙傷分組時(shí)間少于48小時(shí):③樣本及對(duì)照數(shù)目大于3。最終經(jīng)過(guò)芯片質(zhì)量評(píng)估，歸類整理后發(fā)現(xiàn)，由Lederer JA等提交的GSE7404（動(dòng)物模型為小鼠，25％TBSA，Ⅲ度燒傷）數(shù)據(jù)集滿足以上篩選條件。我們從中選取燒傷后第1天組免疫細(xì)胞樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，總共有8個(gè)樣本符合條件，其中4個(gè)為燒傷組，4個(gè)為對(duì)照組。本

3、研究所需GSE7404數(shù)據(jù)是GPL1261平臺(tái)Affymetrix Mouse Genome4302.0Array基因芯片，為全血游離白細(xì)胞基因芯片。
　　2.基因芯片數(shù)據(jù)的處理:由于基因芯片平臺(tái)的差異、系統(tǒng)誤差的存在和后期計(jì)算的需要，我們對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析之前，需要先進(jìn)行預(yù)處理(pre-procession)。預(yù)處理的過(guò)程主要包括:數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除異常數(shù)據(jù)和噪音數(shù)據(jù);補(bǔ)缺失值，保證數(shù)據(jù)的完整性;對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，以滿足正態(tài)分布的分析要

4、求;標(biāo)準(zhǔn)化，糾正系統(tǒng)誤差，以發(fā)現(xiàn)真正的生物學(xué)變異。
　　3.功能富集分析:在本次研究中，我們應(yīng)用GO-function數(shù)據(jù)包對(duì)基因進(jìn)行功能注釋，以有效的處理GO功能中的冗余，使分析結(jié)果更加可靠精確。應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and

5、Genomes)通路富集分析。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）是由日本京都大學(xué)和東京大學(xué)聯(lián)合開發(fā)的數(shù)據(jù)庫(kù)，KEGG通路富集分析是目前常被使用的芯片數(shù)據(jù)基因功能分析方法，它利用的數(shù)據(jù)是一些已經(jīng)研究清楚的基因之間的相互作用，即就是生物通路。本研究通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)所篩選刺激反應(yīng)相關(guān)差異基因，并選取刺激反應(yīng)相關(guān)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析后，選取與燒傷后

6、免疫細(xì)胞刺激反應(yīng)相關(guān)通路。
　　4.刺激反應(yīng)相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析:將選取的免疫系統(tǒng)相關(guān)差異基因應(yīng)用DAVID進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換，將轉(zhuǎn)換的差異基因輸入到STRING9.1數(shù)據(jù)庫(kù)中，選取交互作用評(píng)分大于0.4（中等可信度）的互作關(guān)系構(gòu)建刺激反應(yīng)相關(guān)差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction network）。網(wǎng)絡(luò)分析及MCL子網(wǎng)絡(luò)聚類分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件進(jìn)行。ST

7、RING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string.embl.de)是一個(gè)搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)，它不僅包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間直接的物理的相互作用，而且包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間間接功能的相關(guān)性。Cytoscape作為一個(gè)開源性網(wǎng)絡(luò)分析和可視化數(shù)據(jù)分析軟件，目前它可以將生物分子交互網(wǎng)絡(luò)與高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息整合建構(gòu)可視化的分子交互作用網(wǎng)絡(luò)，并且對(duì)大規(guī)模蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用、蛋白質(zhì)和DNA之間等交互作

8、用的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.基因芯片分析結(jié)果:在燒傷后第一天差異基因進(jìn)行基因功能本體(GO)分析顯示，共有259個(gè)刺激反應(yīng)相關(guān)差異基因被選出，其中上調(diào)基因118個(gè)，下調(diào)基因141個(gè)。通過(guò)KEGG通路富集結(jié)果顯示前10個(gè)通路符合閾值要求并被顯著富集。主要為包括免疫系統(tǒng)相關(guān)通路（toll樣受體信號(hào)通路;B細(xì)胞受體信號(hào)通路;T細(xì)胞受體信號(hào)通路等）;細(xì)胞過(guò)程中的細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡相關(guān)通路(p53信號(hào)通路;細(xì)胞凋亡通路);環(huán)

9、境信息進(jìn)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路。其中差異基因富集最多、最顯著的為toll樣受體信號(hào)通路。
　　2.刺激反應(yīng)相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析:在刺激反應(yīng)相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中共由226個(gè)節(jié)點(diǎn)，1232條邊組成，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中位于中心位置并且與其他蛋白或基因具有最大互作關(guān)系的蛋白或者基因在生物學(xué)過(guò)程中具有更重要的意義。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中我們發(fā)現(xiàn)Jun(Stress=67)、Stat1(Stress=67)、Bcl2(Stress=56)、Stat

10、3(Stress=54)、Tlr2(Stress=47)、Myd88(Stress=45)、Jak2(Stress=41)、Lck(Stress=40)、Hck(Stress=38)、Ptpn6(Stress=38)10個(gè)基因位于網(wǎng)絡(luò)中心，具有最高互作關(guān)系。為了篩選出與刺激反應(yīng)過(guò)程相關(guān)的重要的節(jié)點(diǎn)基因，我們通過(guò)MCL分析方法對(duì)原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，選取力度系數(shù)大于4.0，互作關(guān)系大于6的網(wǎng)絡(luò)模塊進(jìn)行下一步分析。我們發(fā)現(xiàn)MCL分析

11、總共有7個(gè)子網(wǎng)絡(luò)被選出。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)對(duì)小鼠燒傷后一天全血游離白細(xì)胞基因芯片分析我們發(fā)現(xiàn)Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun基因在燒傷早期應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用，是潛在的生物靶標(biāo)。
　　第二部分 運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證靶標(biāo)基因
　　目的：
　　通過(guò)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證小鼠燒傷后刺激反應(yīng)相關(guān)重要靶標(biāo)基因。
　　方法：
　　動(dòng)物分組及燙傷模型建立:選取50只健康成

12、年BALB/c小鼠，體重22-24g，雌雄不限，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，并清潔級(jí)飼養(yǎng)。分組:假燒傷（Sham）組10只，實(shí)驗(yàn)組40只，實(shí)驗(yàn)組按燙傷后時(shí)間分為燙傷后2h、6h、12h和24h組。模型建立:小鼠用1％的戊巴比妥鈉(50m g/kg)腹腔麻醉后，將小鼠背部備皮，盡量不傷及皮膚，硫化鈉去盡背部毛發(fā)，背部脫毛區(qū)域大小4*4cm（約25％TBSA），將小鼠固定于操作板上。將小鼠背部脫毛區(qū)域置于97℃熱水中燙傷15秒（導(dǎo)致25

13、％Ⅲ度燙傷創(chuàng)面），燙傷后立即腹腔注射0.9％無(wú)菌生理鹽水1ml抗休克處理，創(chuàng)面使用碘伏消毒后，再無(wú)菌紗布包扎。根據(jù)時(shí)間點(diǎn)行眼部取血，并提取血液中的白細(xì)胞，最后用Real-time qPCR法檢測(cè)小鼠燒傷后白細(xì)胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.以MM-GAPDH為內(nèi)參，我們使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細(xì)胞中Lck mRNA的相

14、對(duì)表達(dá)量。以sham組為對(duì)照，小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細(xì)胞中Lck mRNA相對(duì)表達(dá)量(x±s)如下:0.817±0.108、0.644±0.186、0.369±0.120、0.536±0.131，各組與對(duì)照組相比較，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，小鼠燙傷后Lck mRNA的表達(dá)量在12h處于較低水平，在燙傷后24h內(nèi)整體表達(dá)下降趨勢(shì)。
　　2.以MM-GAPDH為內(nèi)參，我們使用熒光定量PCR

15、技術(shù)檢測(cè)了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細(xì)胞中Stat-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以sham組為對(duì)照，小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細(xì)胞中Stat-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(x±s)如下:0.780±0.127、0.527±0.136、0.338±0.157、0.219±0.110，各組與對(duì)照組相比較，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，小鼠燙傷后Stat-1 mRNA的表達(dá)量在24h處于最低水平，在燙傷

16、后24h內(nèi)整體表達(dá)持續(xù)下降趨勢(shì)。
　　3.以MM-GAPDH為內(nèi)參，我們使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細(xì)胞中Myd88 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以sham組為對(duì)照，小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細(xì)胞中Myd88 mRNA相對(duì)表達(dá)量(x±s)如下:1.498±0.114、1.399±0.082、1.433±0.160、1.434±0.200，各組與對(duì)照組相比較，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

17、.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，小鼠燙傷后Myd88 mRNA的表達(dá)量在2h表達(dá)量明顯增加，在燙傷后24h內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)高表達(dá)。
　　4.以MM-GAPDH為內(nèi)參，我們使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細(xì)胞中Stat-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以sham組為對(duì)照，小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細(xì)胞中Stat-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量(x±s)如下:1.424±0.107、1.529±0.094、1.39