1、近年來，由于環(huán)境變化、自然災(zāi)害、物種多樣性變化等因素，導致各種病毒引起的傳染性疾病不斷爆發(fā)并重復(fù)性出現(xiàn)，如SARS病毒、H1N1、H7N9禽流感病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒以及這兩年來談之色變的埃博拉病毒，寨卡病毒等。而且隨著全球化進程的加快以及傳染病病原體傳播途徑的多變性，使得這些傳染病的爆發(fā)不再是局部地域出現(xiàn)，更是在全球范圍內(nèi)迅速流行，給人類健康和社會帶來極大的危害。因此，對傳染性疾病的防控、診斷和治療已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的熱點和

2、重點。
　　然而傳統(tǒng)的傳染性病原體檢測方法大都只適用于實驗室部署環(huán)境，具有檢測過程分散、繁瑣、實驗操作復(fù)雜、對環(huán)境敏感等缺點，并且對實驗員的實驗技能要求較高。這些弊端都大大限制了傳統(tǒng)檢測技術(shù)在現(xiàn)場傳染病檢測中的應(yīng)用。傳染病病原體現(xiàn)場快速檢測要求具有操作簡單、成本低、便攜和易于實現(xiàn)自動化等特點，因此，急需尋找一種新的技術(shù)平臺以滿足傳染病的現(xiàn)場檢測需求。
　　本論文首先利用3D打印技術(shù)，設(shè)計并制作了封閉式的檢測卡盒，在此基礎(chǔ)上研

3、發(fā)了全自動的便攜式核酸檢測系統(tǒng)，并對儀器進行了各項性能測試及實際現(xiàn)場傳染病的檢測，成功地完成了現(xiàn)場傳染病從樣本輸入到結(jié)果輸出的自動化檢測過程。具體內(nèi)容包括:
　　1.基于3D打印技術(shù)的封閉式檢測卡盒的設(shè)計與制造
　　首先根據(jù)病原體核酸檢測的實驗流程明確了封閉式卡盒的設(shè)計需求，提出了基于柔性滑片的封閉式卡盒結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部各功能模塊。整個設(shè)計與制造過程采用了高精度的3D打印技術(shù)及醫(yī)用級PC-ABS材料，共經(jīng)歷5個批次的快速迭代試制

4、過程，設(shè)計和優(yōu)化了卡盒7個特殊零件的結(jié)構(gòu)，組裝完成的卡盒尺寸為140 mm×90 mm×30 mm。其內(nèi)部集成移液模塊、樣本處理及檢測區(qū)域，樣本處理范圍為20～1000μL，可同時進行1～6項實時熒光PCR檢測。液體操作范圍為2～200μL，實測在10μL和100μL處的移液相對誤差分別為1.71％和0.76％，重復(fù)性CV值分別為2.3％和0.77％，均優(yōu)于國標規(guī)定。同時，對卡盒內(nèi)的磁珠法核酸提取及PCR配制過程進行了優(yōu)化。最后，實驗證

5、明了上游核酸提取試劑的揮發(fā)對于下游PCR檢測并未造成抑制影響，說明了在封閉式卡盒內(nèi)進行一體化核酸檢測是可行的。
　　2.基于封閉式卡盒的現(xiàn)場病原體檢測系統(tǒng)的研發(fā)
　　以封閉式卡盒為基礎(chǔ)，研發(fā)了與之配套的自動化驅(qū)動系統(tǒng)，其內(nèi)部由移液控制、磁分離加熱、熱循環(huán)、熒光采集及輔助電路等功能模塊組成。其中，移液控制模塊的最大操作量程為260μL，精度為0.118μL，內(nèi)含濾芯以防止交叉污染;磁分離加熱模塊采用傾斜式滑動結(jié)構(gòu)，可程序化控制

6、磁富集的位置，且溫控精度為±0.5℃，可在2 min內(nèi)升至目標溫度;熱循環(huán)模塊可提供3通道的PCR反應(yīng)條件，其升降溫速度分別為4.6℃/s及4.0℃/s，控制精度為±0.3℃;熒光采集模塊提供雙色熒光通道（FAM/SYBR Green和Texas Red波長的范圍的），采用單色LED作為激發(fā)光源，波動性小于1μW，單次熒光信號的采集在2.5s內(nèi)完成。儀器整體尺寸為270 mm×275 mm×250 mm，重量為6.5 kg?，F(xiàn)場操作時僅

7、需將帶樣本的卡盒放入儀器中，并配置實驗參數(shù)，則可自動完成整個檢測流程。
　　3.現(xiàn)場病原體檢測系統(tǒng)的性能測試
　　首先使用百日咳病毒質(zhì)粒DNA進行了核酸提取效率的對比實驗，系統(tǒng)和手工提取的效率分別為95.49％和84.33％;使用HBV質(zhì)粒DNA測試獲得了104copies/mL的提取限，說明系統(tǒng)的樣本處理能力在效率和靈敏度方面均可滿足下游PCR檢測的需求。同時，分別使用E.coli及HBV病毒的真實臨床樣本進行了核酸提取對

8、比實驗，結(jié)果顯示采用本系統(tǒng)操作在產(chǎn)量上比手工操作分別高出6.6 ng/μL和0.93 ng/μL。通過平行實驗測得本系統(tǒng)的實時熒光PCR檢測孔間差異為0.023（CV值），檢測限為104 copies/mL。最后，使用本系統(tǒng)連續(xù)運行20次陰性和陽性樣本的間隔實驗，測試結(jié)果與預(yù)期一致，表明系統(tǒng)沒有發(fā)生批間交叉污染的現(xiàn)象。
　　4.現(xiàn)場傳染病檢測實驗
　　在江蘇省疾病防控中心進行了腺病毒的檢測實驗，并采用羅氏LightCycle

9、r2.0熒光定量PCR儀進行實驗對照，獲得未知樣本的Ct值分別為31.15和31.68，陽參的Ct值分別為27.52和28.01，從擴增曲線形態(tài)和Ct值的比較說明兩系統(tǒng)的檢測結(jié)果較為一致。最后，使用本卡盒系統(tǒng)對沙門氏菌及志賀氏菌進行聯(lián)合檢測，并設(shè)置卡盒內(nèi)采用懸滴加樣的方式進行PCR體系的配置，同時采用ABISteponePlus實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行實驗對照。兩系統(tǒng)的擴增曲線形態(tài)一致，兩路熒光檢測(FAM and Texas Red