1、高致病性豬鏈球菌病、炭疽病、高致病性禽流感、腎綜合征出血熱等自然疫源性疾病病死率高，又多通過(guò)野外環(huán)境中的媒介節(jié)肢動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、禽類(lèi)傳播，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)甚至接觸的人群，以及野外訓(xùn)練官兵、作戰(zhàn)部隊(duì)的健康和生命安全。這些重要的自然疫源性疾病，平時(shí)亦可引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件，引起普遍恐慌。另外值得注意的是，部分國(guó)家或地區(qū)已經(jīng)將自然疫源性疾病病原列入生物戰(zhàn)計(jì)劃當(dāng)中，作為生物戰(zhàn)/生物恐怖病原。上述疫病的早期臨床表現(xiàn)常常難以鑒別，最終病因確

2、認(rèn)有賴(lài)病原檢測(cè)，盡快篩查并明確診斷對(duì)控制疫情至關(guān)重要。
　　易于現(xiàn)場(chǎng)使用的膠體金免疫層析技術(shù)，存在難以克服的敏感性問(wèn)題;核酸檢測(cè)方法目前主要為PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR，但昂貴精密的PCR儀難以在現(xiàn)場(chǎng)展開(kāi)，成為其被廣泛使用的障礙。病原應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)是能早期在疫源地快速檢測(cè)出病原特異性的致病基因和毒力基因，敏感性好;無(wú)需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳或雜交后的復(fù)雜清洗步驟，操作簡(jiǎn)單，易于規(guī)范;成本適宜或低廉。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)及

3、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù)恰恰具有上述特點(diǎn)，在應(yīng)用于自然疫源性疾病病原檢測(cè)方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)。
　　本研究針對(duì)多種重要和新發(fā)自然疫源性疾病病原體，研究快速篩查檢測(cè)的LAMP/RT-LAMP方法及配套便攜裝備。綜合應(yīng)用可視化LAMP/RT-LAMP全封閉檢測(cè)技術(shù)，研究對(duì)自然疫源性疾病病原進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的方法和檢測(cè)試劑（引物、反應(yīng)體系），可檢測(cè)高致病性豬鏈球菌2型、炭疽桿菌（可鑒定強(qiáng)毒株、弱毒株）、H7N9禽流感病毒

4、、腎綜合征出血熱病毒（可區(qū)分漢城型、漢灘型）等自然疫源性疾病病原，具有快速、敏感的特點(diǎn)。在建立病原LAMP檢測(cè)方法的同時(shí)，還設(shè)計(jì)制作一套便攜式恒溫檢測(cè)箱組（基于小型恒溫金屬浴的可視化LAMP檢測(cè)箱），采用車(chē)載逆變電源和鋰電池供電，可立足自身保障，在疫情現(xiàn)場(chǎng)或野外進(jìn)行篩查檢測(cè)。
　　具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　一、Cps2j-LAMP和Salk-LAMP檢測(cè)方法的建立及其在快速鑒定高致病性S.suis2中的應(yīng)用
　　豬

5、鏈球菌2型是豬鏈球菌病最主要的病原，也是一些發(fā)展中國(guó)家急性細(xì)菌性腦膜炎的主要病原，其中引發(fā)鏈球菌中毒性休克綜合癥（死亡率達(dá)80％以上）的高致病性強(qiáng)毒株含有獨(dú)特的“89K毒力島”，可作為判定豬鏈球菌2型毒力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。本研究建立了快速檢測(cè)高致病性豬鏈球菌2型及其89K毒力島的LAMP檢測(cè)方法，最快只需擴(kuò)增18 min即可出檢測(cè)結(jié)果，靈敏度可達(dá)7.16拷貝每反應(yīng)。還應(yīng)用完全相同的一套核酸梯度稀釋模板（豬鏈球菌05ZYH33株），針對(duì)建立

6、的同一細(xì)菌不同靶基因的兩套LAMP反應(yīng)體系，對(duì)目前LAMP技術(shù)的五種常見(jiàn)終點(diǎn)可視化檢測(cè)方法進(jìn)行了測(cè)試比較。
　　二、炭疽桿菌雙重可視化LAMP檢測(cè)方法的建立及其在強(qiáng)弱毒株判定中的應(yīng)用
　　選擇炭疽桿菌編碼保護(hù)性抗原的PA基因（在pX01毒力質(zhì)粒上），以及與莢膜合成相關(guān)的capA基因（在pX02毒力質(zhì)粒上）作為檢測(cè)靶基因，建立了一種能實(shí)現(xiàn)不開(kāi)蓋，無(wú)需濁度儀即能實(shí)現(xiàn)肉眼可視化檢測(cè)，又同時(shí)能區(qū)分強(qiáng)毒株、弱毒株或無(wú)毒株（即可初步判定

7、毒力）的雙重LAMP檢測(cè)方法，檢出限均為50拷貝每反應(yīng)。除雙重LAMP法檢測(cè)炭疽桿菌外，本研究還制備一種用于炭疽桿菌核酸檢測(cè)的通用陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可兼容目前的絕大部分炭疽桿菌核酸檢測(cè)方法，具有全面性、普遍適用性和可比性;組裝了LAMP法檢測(cè)炭疽桿菌的凍干粉試劑盒，可常溫儲(chǔ)存，有可能應(yīng)用于應(yīng)對(duì)突發(fā)傳染病疫情和現(xiàn)場(chǎng)反生物恐怖襲擊預(yù)警等。
　　三、高致病性H7N9禽流感RT-LAMP檢測(cè)方法建立與臨床應(yīng)用
　　建立了快速檢測(cè)H7N

8、9禽流感病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法，只需12 min至23 min內(nèi)即可出擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。其中檢測(cè)血凝素(HA)基因的RT-LAMP(H7-RT-LAMP)的敏感性與WHO推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(H7-rRT-PCR)的敏感性相同;而檢測(cè)神經(jīng)氨酸酶(NA)基因的N9-RT-LAMP比WHO推薦的N9-rRT-PCR方法靈敏100倍。本研究應(yīng)用135例臨床標(biāo)本（包括患者和禽類(lèi)標(biāo)本）對(duì)建立的H7N9禽流感病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行了

9、測(cè)試比較:對(duì)已確診病例的檢測(cè)均為陽(yáng)性;對(duì)疫情爆發(fā)期間某活禽市場(chǎng)禽類(lèi)標(biāo)本的檢測(cè)，陽(yáng)性率為20.87％(24/115)。在H7基因核酸檢測(cè)陽(yáng)性的樣品中，N9-RT-LAMP對(duì)N9基因的檢出率顯著高于對(duì)應(yīng)的N9-rRT-PCR。這種對(duì)于N9基因片段的高辨別力，可能有助于更好的將H7N9病毒從H7N1、H7N2、H7N3、H7N7等其它H7亞型病毒中區(qū)分出來(lái)。
　　四、腎綜合征出血熱病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立與臨床測(cè)試
　　腎

10、綜合征出血熱病例集中在山區(qū)和丘陵地帶，中國(guó)是全球疫情最為嚴(yán)重的國(guó)家。本研究建立了腎綜合征出血熱病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法，并能區(qū)分目前在中國(guó)的主要流行株漢灘型病毒、漢城型病毒，具有操作簡(jiǎn)便、快速、特異、敏感的特點(diǎn)，結(jié)合終點(diǎn)檢測(cè)的羥基萘酚藍(lán)(HNB)法，可以直接通過(guò)顏色變化肉眼判斷結(jié)果，實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)需開(kāi)蓋，減少污染風(fēng)險(xiǎn)，有可能作為目前腎綜合征出血熱病毒血清學(xué)檢測(cè)方法的有益補(bǔ)充。
　　五、病原核酸恒溫現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)箱的研制
　　為解決

11、野外、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的瓶頸問(wèn)題（無(wú)市電、無(wú)冷鏈、無(wú)工作臺(tái)面），組裝了基于恒溫?cái)U(kuò)增和凍干技術(shù)，包含能常溫儲(chǔ)備的凍干粉可視化檢測(cè)試劑、小型儀器及必需耗材（加樣器、吸頭、常溫下核酸抽提的磁珠試劑等），能夠在現(xiàn)場(chǎng)完成LAMP（或病毒類(lèi)的逆轉(zhuǎn)錄LAMP）恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)全過(guò)程的便攜式試劑箱組。設(shè)計(jì)為除市電外，還可使用鋰電池，或車(chē)載逆變電源模塊供電（通用于普通汽車(chē)），便于野外機(jī)動(dòng)使用。
　　研究結(jié)果表明，對(duì)于高致病性豬鏈球菌病、炭疽病、H7N9禽流感、