1、背景：新發(fā)中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）嚴(yán)重威脅人類健康，致死率遠(yuǎn)高于2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)，達(dá)40％以上。最近一次大爆發(fā)是去年5月份，在韓國(guó)引起了183人感染，死亡33人。冠狀病毒是一種廣泛存在，重組率高，種類繁多，主要誘發(fā)人類呼吸系統(tǒng)疾病的病毒，目前抗冠狀病毒藥物研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠?？刂撇《緩?fù)制的復(fù)制酶復(fù)合體（RC）的形成依賴其主要蛋白酶(木瓜樣蛋白酶PLpro和3C樣蛋白酶3CLpro)

2、，而這兩種蛋白酶是冠狀病毒所特有，在人體內(nèi)并沒(méi)有與其相似或相同的蛋白，抑制病毒蛋白酶催化功能就可有效抑制病毒對(duì)底物的切割，從而阻斷病毒復(fù)制。本課題設(shè)想通過(guò)構(gòu)建一個(gè)基于熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的生物傳感器，能夠在細(xì)胞水平對(duì)冠狀病毒蛋白酶作用機(jī)制進(jìn)行模擬，檢測(cè)蛋白酶對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白體的切割活性，進(jìn)一步利用該模型高靈敏度、高通量地篩選蛋白酶抑制劑。以此生物傳感系統(tǒng)及蛋白酶特異性切割的原理進(jìn)一步研究PLpro和3CLpro結(jié)構(gòu)并篩選蛋白酶抑制劑，為抗冠狀病

3、毒藥物研究奠定基礎(chǔ)。
　　目的：建立基于生物傳感器的冠狀病毒蛋白酶活性測(cè)定模型，利用該模型研究人類MERS-CoV PLpro和3CLpro對(duì)催化底物及保守序列的識(shí)別特性，比較不同冠狀病毒蛋白酶活性的差異。并進(jìn)一步利用建立的模型進(jìn)行抗病毒蛋白酶抑制劑篩選，為抗人類冠狀病毒藥物篩選提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：首先，合成MERS-CoV PLpro和MERS-CoV3CLpro以及其各自底物pGlo-30F-M-nsp1/2，2/

4、3，3/4(PLpro)，4/5，5/6，6/7，7/8(3CLpro)的生物傳感器基因構(gòu)建體。其次，利用PCR定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑Lpro/3CLpro蛋白酶催化活性中心Cys-His-Asp(PLpro)/His-Cys(3CLpro)分別突變?yōu)锳la，從而構(gòu)建蛋白酶活性缺失突變體，同時(shí)構(gòu)建酶切底物pGlo-30F-M-nsp2/3，pGlo-30F-M-nsp7/8各識(shí)別位點(diǎn)的相應(yīng)突變體。再次，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法測(cè)定MER

5、S PLpro/3CLpro蛋白酶對(duì)底物的識(shí)別功能，比較不同冠狀病毒蛋白酶活性差異，并使用蛋白印跡法檢測(cè)蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量。最后利用基于熒光素酶的冠狀病毒蛋白酶活性檢測(cè)的生物傳感器篩選冠狀病毒蛋白酶候選抑制劑。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建 MERS PLpro蛋白酶生物傳感器，其主要部件包括 MERS PLpro、基因工程構(gòu)建攜帶蛋白酶底物序列的傳感器質(zhì)粒，該模型作用原理是質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞表達(dá)后，蛋白酶識(shí)別切割底物，使得

6、連接底物傳感器的熒光素酶發(fā)生構(gòu)象變化，兩個(gè)亞基結(jié)合到一起，從而激活熒光素酶底物釋放熒光，一旦不識(shí)別則構(gòu)象變化受到限制，難以激活熒光素酶，釋放的熒光量顯著較低。通過(guò)檢測(cè)熒光量間接表現(xiàn)蛋白酶的活性。該模型對(duì)不同底物切割的特異性，驗(yàn)證了該傳感器模型成功建立。
　　2.應(yīng)用MERS PLpro蛋白酶的生物傳感器，研究驗(yàn)證MERS PLpro特異性識(shí)別切割非結(jié)構(gòu)蛋白位點(diǎn)：在HEK293T細(xì)胞中，MERS PLpro切割蛋白酶底物nsp2/3

7、和nsp3/4更徹底，不完全切割底物nsp1/2。分別突變MERS PLpro各個(gè)蛋白酶催化活性位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)蛋白酶對(duì)底物的識(shí)別切割效率顯著降低。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)傳感器底物pGlo-30F-M-nsp2/3的識(shí)別序列突變后，PLpro對(duì)位點(diǎn)LVGG的突變底物識(shí)別切割效率也明顯減弱。提示MERS-CoV PLpro特異性識(shí)別并切割底物，且識(shí)別位點(diǎn)高度保守序列，此切割作用依賴PLpro蛋白酶催化位點(diǎn)。
　　3.不同冠狀病毒PLpro

8、蛋白酶活性研究：使用MERS-CoV的傳感器底物，比較了SARS/MERS PLpro和PEDV/NL63 PLP2的識(shí)別切割效率。結(jié)果顯示，SARS和MERS兩種冠狀病毒的PLP蛋白酶存在很大相似性，而PEDV對(duì)其底物的切割效率較低，提示這種顯著的切割差異可能與病毒的種屬差異相關(guān)。
　　4.成功構(gòu)建MERS3CLpro蛋白酶生物傳感器，組成部分包括MERS3CLpro、基因工程構(gòu)建的攜帶蛋白酶底物序列傳感器質(zhì)粒，通過(guò)對(duì)底物切割，

9、驗(yàn)證了3CLpro蛋白酶生物傳感器模型成功建立。應(yīng)用MERS3CLpro蛋白酶的生物傳感器，研究了MERS3CLpro特異性地切割釋放底物蛋白：在HEK293T細(xì)胞中，MERS3CLpro切割蛋白酶底物nsp5/6和nsp7/8更徹底，不完全切割底物nsp6/7。分別突變MERS3CLpro的兩個(gè)催化活性位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)對(duì)各個(gè)蛋白酶底物的識(shí)別切割效率顯著降低。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)傳感器底物pGlo-30F-M-nsp7/8的識(shí)別序列突變后，

10、3CLpro對(duì)位點(diǎn)LQA的突變底物識(shí)別切割效率也明顯減弱。提示MERS-CoV3CLpro特異性識(shí)別并切割底物蛋白的高度保守序列，且此切割作用依賴 PLpro蛋白酶催化位點(diǎn)。
　　5.不同冠狀病毒3CLpro蛋白酶活性研究：分別使用SARS和MERS兩種冠狀病毒的傳感器底物，比較了SARS和MERS3CLpro的識(shí)別切割效率。結(jié)果顯示， SARS和MERS兩種冠狀病毒的3CL蛋白酶對(duì)不同底物的切割效率的趨勢(shì)一致，由此可見(jiàn)冠狀病毒蛋

11、白酶功能的保守性，另外相比較而言 SARS蛋白酶的切割活性較高，也可反映出切割效率與病毒傳播快慢的關(guān)系。
　　6.基于以上研究基礎(chǔ)，本課題應(yīng)用MERS PLpro和3CLpro兩個(gè)生物傳感器篩選了大量的化合物，包括小分子抗 SARS藥物、天然提取藥物等，目前初步得到能夠抑制MERS3CLpro活性的SARS3CLpro蛋白酶抑制劑Cinaserin。
　　結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了基于生物傳感器的MERS-CoV蛋白酶活性測(cè)定模