1、生物分子（如三磷酸腺苷、DNA）的檢測(cè)在疾病診斷、基因治療、醫(yī)療預(yù)防以及環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有重要意義。發(fā)展快速、方便、靈敏的生物傳感器備受關(guān)注。本論文研究工作，以DNA為核心，利用電化學(xué)和熒光等檢測(cè)手段，設(shè)計(jì)了分析檢測(cè)DNA和三磷酸腺苷(ATP)的生物傳感器。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　第一章，前言。介紹了DNA傳感器的基本知識(shí)，重點(diǎn)闡述了基于DNA的生物傳感器在比色、電化學(xué)和熒光領(lǐng)域的研究進(jìn)展。以及基于核酸外切酶Ⅲ(Exonuclea

2、seⅢ(ExoⅢ))和T4 DNA連接酶信號(hào)放大的DNA生物傳感器的研究進(jìn)展，闡明了本論文的選題依據(jù)和研究?jī)?nèi)容。
　　第二章，介紹了具有特異性的免標(biāo)記電化學(xué)DNA傳感器用于目標(biāo)DNA的靈敏檢測(cè)。以亞甲基藍(lán)作為電活性物質(zhì)，結(jié)合ExoⅢ酶放大作用，設(shè)計(jì)了雙鏈DNA為固定探針的檢測(cè)體系。雙鏈DNA探針由AP鏈和SP-15雜交而成，通過(guò)巰基與金電極的作用自組裝于金電極表面。SP-15由三部分組成:Ⅰ部分是和目標(biāo)DNA相匹配的系列;Ⅱ部分是

3、與AP探針相雜交的系列;Ⅲ部分是具有不同數(shù)目的游離鳥(niǎo)嘌呤系列，其能與亞甲基藍(lán)特異吸附得到較強(qiáng)電信號(hào)。與此相反，AP是沒(méi)有鳥(niǎo)嘌呤的DNA探針。該雙鏈DNA探針形成3'突出端，而不會(huì)被ExoⅢ酶剪切。在檢測(cè)之前，將雙鏈修飾的電極浸沒(méi)于攪拌的亞甲基藍(lán)溶液里，探針中含有大量游離的鳥(niǎo)嘌呤與亞甲基藍(lán)特異吸附而得到較強(qiáng)的初始DPV信號(hào);而目標(biāo)DNA與探針Ⅰ部分相結(jié)合后，使得Ⅰ部分變成平滑的3'端，引發(fā)ExoⅢ酶的酶切作用，釋放出來(lái)的目標(biāo)DNA又可以引

4、發(fā)下一輪剪切。結(jié)果大量探針的Ⅲ部分離開(kāi)電極，而探針AP沒(méi)有游離的鳥(niǎo)嘌呤，所以再次將電極浸沒(méi)于亞甲基藍(lán)溶液后，探針吸附亞甲基藍(lán)的量會(huì)大量減少，而得到較弱的DPV信號(hào)。信號(hào)前后的對(duì)比急劇減小，可以用于指示目標(biāo)DNA量的多少。
　　第三章，介紹了簡(jiǎn)單、快速、靈敏的免標(biāo)記熒光法檢測(cè)ATP。染料SYBR GreenⅠ在水溶液中熒光很弱，但是嵌入雙鍵DNA后熒光增強(qiáng)800-1000倍，而其與單鏈DNA或者核苷酸作用微弱，其熒光強(qiáng)度與水溶液中大

5、小相當(dāng)，該染料常用于DNA生物傳感器領(lǐng)域。ExoⅢ酶可以剪切雙鏈DNA中內(nèi)嵌或平滑的3'端，對(duì)5'端和突出的3'端沒(méi)有剪切能力，對(duì)單鏈DNA的剪切活性很弱，其對(duì)底物DNA系列沒(méi)有要求。核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)是另一種對(duì)底物DNA系列沒(méi)要求的剪切酶，其能對(duì)單鏈DNA從3'端到5'端按順序水解磷酸二脂鍵。再結(jié)合T4 DNA連接酶需以ATP作為輔酶的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了環(huán)狀DNA探針。環(huán)形探針由兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針（P1和P2）按同濃度雜交而成。

6、因?yàn)橄蛏虾Ｉべ?gòu)買(mǎi)DNA時(shí)，DNA的5'端為了控制合成方向，5'端要求除去磷酸基團(tuán)，而T4 DNA連接酶是催化生成磷酸二脂鍵的，所以要求P1和P2的5'端另外修飾磷酸基團(tuán)。在檢測(cè)之前，T4 DNA連接酶不能發(fā)揮其作用，而使得環(huán)形探針的酶切位點(diǎn)暴露于ExoⅢ酶和ExoⅠ酶。兩種剪切酶將探針?biāo)獬蓡蝹€(gè)核苷酸，由于熒光染料SGⅠ與單個(gè)游離的核苷酸作用微弱，得到非常弱的背景噪音;而加入ATP之后，T4 DNA連接酶將其作為輔酶能量因子，發(fā)揮酶作

7、用，將環(huán)形探針催化形成閉合的DNA探針，其ExoⅠ和ExoⅢ的酶切位點(diǎn)均被屏蔽。染料SGⅠ大量的嵌入的雙鏈DNA中，得到增強(qiáng)的熒光作用。利用ExoⅠ和ExoⅢ酶切特點(diǎn)，背景信號(hào)有效的被減弱，使得信噪比大大增強(qiáng)，提高分析靈敏度。其熒光信號(hào)增加的程度與ATP濃度相關(guān)，有利于定量分析。
　　第四章，介紹了signal-off的電化學(xué)DNA傳感器，設(shè)計(jì)了修飾生物素的分子發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針，結(jié)合ExoⅢ酶的放大作用實(shí)現(xiàn)靈敏的DNA檢測(cè)。固

8、定于金電極的DNA探針，其突出的3'端核苷酸被生物素修飾，其與親和素與HRP的聚合物（SA-HRP）相作用，在雙氧水的催化下，大量催化TMB的氧化，再在電極上施加還原電位，因此可以得到較強(qiáng)的還原電流。而在目標(biāo)DNA存在條件下，其與DNA探針發(fā)生雜交，得到平滑的3'端，使得修飾了生物素的核苷酸被ExoⅢ酶剪切。因此，TMB的還原電信號(hào)急劇下降。該方法靈敏，并具有很好的選擇性，檢測(cè)限達(dá)到10fM.
　　第五章，研究開(kāi)發(fā)了快速、免熒光基