1、脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)，又稱(chēng)三?；视王；饷?，是指分解或合成高級(jí)脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯鍵的酶，是催化油酯水解的一類(lèi)酶的總稱(chēng)。脂肪酶在自然界中來(lái)源廣泛，植物、動(dòng)物、微生物中都可以產(chǎn)生脂肪酶，是最早被發(fā)現(xiàn)的酶之一。微生物脂肪酶由于來(lái)源廣泛，作用溫度和pH范圍廣，底物專(zhuān)一性高，是目前商業(yè)性脂肪酶的主要來(lái)源，真菌產(chǎn)生的脂肪酶是目前在工業(yè)和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最多的。目前許多微生物、哺乳動(dòng)物的脂肪酶基因已經(jīng)被克隆，部

2、分已經(jīng)在大腸桿菌、酵母系統(tǒng)、米曲霉等系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)?，F(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，使得人們可以從分子水平對(duì)脂肪酶進(jìn)行改造。 來(lái)自擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum FS1884)的堿性脂肪酶是一種具有廣泛應(yīng)用前景的脂肪酶，擴(kuò)展青霉FS1884脂肪酶目前已經(jīng)在進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，為了獲得溫度穩(wěn)定性和酶比活提高的突變體，經(jīng)常使用誘變育種的方法得到突變體，但是傳統(tǒng)的誘變育種方法存在一定的局限性，針對(duì)以上原因，本課題首先獲得擴(kuò)展青霉脂肪

3、酶基因，對(duì)其脂肪酶基因進(jìn)行異源表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行分子改造。主要研究結(jié)果如下： 提取擴(kuò)展青霉Penicillium expansum FS1884總RNA，根據(jù)同一突變系譜中另一菌株P(guān)F898脂肪酶序列(GenBank NO. AF284064)設(shè)計(jì)含有BamH I、EcoRI的引物，反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增脂肪酶cDNA全長(zhǎng)，雙酶切并連接到表達(dá)載體pPIC3.5k當(dāng)中，構(gòu)建重組脂肪酶表達(dá)載體pPIC3.5k-PEL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)

4、菌落PCR初步驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子后，測(cè)序驗(yàn)證，cDNA全長(zhǎng)為858bp，與預(yù)期結(jié)果相符。大量提取質(zhì)粒pPIC3.5k-PEL，使用Sal I線(xiàn)性化載體，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上，挑取轉(zhuǎn)化子接種于OMM和MD平板上進(jìn)行陽(yáng)性克隆子的選擇，并提取基因組DNA使用PCR進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，重組脂肪酶PEL-GS在畢赤酵母GS115中得到成功表達(dá)，表達(dá)量為0.6mg/ml。橄欖油乳化液平板和NaOH滴定法鑒定重組脂肪酶活力，最適作用溫

5、度為35℃，最適pH為9.4，最高比活為2952U/mg，酶液在50℃放置30min后水解活力基本消失。 根據(jù)基因一致性原則選擇突變位點(diǎn)，采用一步法對(duì)脂肪酶基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變，共選擇8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變，突變體脂肪酶經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母后均成功表達(dá)，其中突變體PEL-M220V-GS相對(duì)于野生型重組脂肪酶比活提高了5％，其余均有不同程度的下降，PEL-T50P-GS，PEL-L164P-GS，PEL-1102V-GS相對(duì)于野生型脂肪酶的

6、耐熱性有所提高，PEL-L164P-GS的比活雖然只有野生型重組脂肪酶的47％，但是酶的最適作用溫度提高了5℃，為40℃，其余酶的突變體耐熱性均有不同程度的下降，對(duì)突變體脂肪酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，并研究產(chǎn)生酶活差異的原因。 利用保真性較差的Taq DNA聚合酶，改變PCR體系成分，建立脂肪酶基因隨機(jī)突變文庫(kù)，將隨機(jī)突變脂肪酶基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選到突變株ep3，所產(chǎn)突變酶最適pH為9.4，最適作用溫度為35℃，該溫度下