1、分類號(hào)：分類號(hào)：___________密級(jí)密級(jí):__________UDC:___________脂肪脂肪酶Lip906Lip906的定向進(jìn)化及固定化研究的定向進(jìn)化及固定化研究TheMoleculardirectedevolutionimmobilizationfthelipaseLip906姓名：陳小利學(xué)號(hào)：2111440066院系：藥學(xué)院專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)研究方向：微生物與分子生物學(xué)導(dǎo)師姓名：李荷（教授）論文提交日期：2017年

2、4月論文答辯日期：2017年5月學(xué)位授予單位：廣東藥科大學(xué)二○一七年四月廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文脂肪脂肪酶Lip906Lip906的定向進(jìn)化及固定化研究的定向進(jìn)化及固定化研究摘要摘要脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一類能夠特異性催化水解三酰甘油的酶，在微生物以及動(dòng)植物中廣泛存在，但來源于微生物的脂肪酶由于其活性及穩(wěn)定性達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的需求而限制其應(yīng)用，因此諸多蛋白改造技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。實(shí)室前期通過構(gòu)建土壤宏基因組文庫篩選得

3、到的一個(gè)全長906bp的新型脂肪酶基因，將其命名為Lip906。由于其熱穩(wěn)定性達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的需求，本研究通過易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，通過酶的固定化提高其熱穩(wěn)定性。通過易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建突變文庫，最終篩選得到酶活提高的突變脂肪酶Lip5D，其發(fā)生了兩個(gè)堿基突變，一個(gè)為同義突變：G831A；一個(gè)為錯(cuò)義突變：A155G，對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)镼52R。突變酶Lip5D的酶活提高4倍，最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH為7.5；突變酶

4、Lip5D在65C以下保溫2h仍能保持70%左右的相對(duì)酶活，在不同pH(3~10)保溫2h后仍能保持60%左右的相對(duì)酶活，其溫度穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性都有所提高，表明利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)酶的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造是可行的。游離酶對(duì)外界環(huán)境敏感、反應(yīng)過程不好控制且游離酶不能循環(huán)回收利用，本文利用酶的固定化技術(shù)對(duì)突變酶Lip5D進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，殼聚糖對(duì)突變酶Lip5D游離酶的固定化效果最佳，酶活回收率能達(dá)到92%。其最適反應(yīng)溫度為63℃，最適反應(yīng)