1、瓊膠酶AgaB是本試驗(yàn)室從海洋假別單胞菌CY24中克隆得到的一個(gè)新穎的胞外瓊膠酶。研究表明AgaB是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能全新的β-瓊膠酶，降解瓊脂糖的主要產(chǎn)物為新瓊八糖和十糖，最小底物為十二糖，作用機(jī)制為倒位型，在家族劃分上該酶不屬于任何一個(gè)已知的糖苷水解酶家族，這些都不同于已發(fā)現(xiàn)的其它瓊膠酶。AgaB結(jié)構(gòu)上的新穎性和功能上的特異性決定了它在工業(yè)和藥用方面擁有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但是AgaB較低的溫度穩(wěn)定性(在高于35℃的情況下容易失去酶的活性)

2、限制了它在工業(yè)上的更大規(guī)模的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)室前期工作建立了耐熱性明顯提高的突變株M446，但其催化活性相比于野生型下降了20％。本論文旨在通過(guò)定向進(jìn)化的方法，在保持M446耐熱性的前提下提高其催化活性。 定向進(jìn)化的兩個(gè)關(guān)鍵步驟是建立分子的多樣性文庫(kù)和高通量篩選體系。本文采用易錯(cuò)PCR和化學(xué)誘變來(lái)建立分子的多樣性，以組成型表達(dá)載體pBS-ks(sv)作為載體建立突變體文庫(kù)。易錯(cuò)PCR引起的堿基突變多發(fā)生在胸腺嘧啶和腺嘌呤位點(diǎn)，而化學(xué)誘

3、變劑甲基磺酸乙酯主要引起鳥(niǎo)嘌呤位點(diǎn)的突變，在一定程度上彌補(bǔ)了易錯(cuò)PCR的不足。根據(jù)瓊膠酶水解瓊膠引起瓊膠液化在平板上產(chǎn)生透明水解圈，而且相對(duì)酶活較高的突變株在平板上形成較大的水解圈的特性建立了高通量篩選體系。突變菌株在37℃下過(guò)夜培養(yǎng)，篩選水解圈/菌落克隆直徑大于野生型菌的克隆，作為研究對(duì)象進(jìn)行發(fā)酵液上清和純酶水平上的進(jìn)一步鑒定。最終我們獲得了一個(gè)熱穩(wěn)定性和產(chǎn)物性質(zhì)沒(méi)有改變而比活力為M446 3倍的突變株，命名為M117。測(cè)序結(jié)果表明，

4、M117發(fā)生了四處堿基替代，其中兩處引起了氨基酸替代，分別是Arg9→Lys，Ilell 1→Val，另兩處為無(wú)義突變。其中第9位的氨基酸突變存在于信號(hào)肽區(qū)域，該區(qū)域在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的時(shí)候被切除，對(duì)成熟酶的比活力沒(méi)有影響，由此，可以推斷引起突變株M117比活力提高的主要原因是第111位氨基酸的突變。 為了推測(cè)突變株M117催化活性提高的機(jī)制，我們分別測(cè)定了M117與M446的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果表明，突變株M117的K<,m>值比M

5、446降低了14倍，而其K<,cat>值變化不明顯。由此可以推斷，突變株M117催化活性提高的主要原因是酶與底物的結(jié)合能力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸替代為纈氨酸替代了異亮氨酸，二者均 為疏水性氨基酸，但是纈氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)比異亮氨酸的小，推測(cè)第111位的氨基酸可能位于底物結(jié)合位點(diǎn)附近或者屬于底物結(jié)合位點(diǎn)的一部分，而短的側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)底物進(jìn)入催化腔的空間位阻比較小，有利于底物與底物結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。另一方面，因?yàn)楫惲涟彼崤c纈氨酸的性質(zhì)比較類