亞油酸異構(gòu)酶相關性及定向進化菌株構(gòu)建和酶性質(zhì)的研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩156頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領

文檔簡介

1、共軛亞油酸(Conjugated Linoleic Acid, CLA)是一類由不同位置和幾何異構(gòu)體組成的擁有兩個共軛雙鍵的十八碳二烯酸。它廣泛存在于多種食物中,CLA具有多種生理活性,但不同類型的CLA生理活性不盡相同。本研究從兩種亞油酸異構(gòu)酶的克隆表達入手,比較兩者差異,探索一種通過流式細胞術(shù)與綠色熒光蛋白標簽質(zhì)粒聯(lián)合篩選正突變子的快速篩選方法,優(yōu)化突變酶的產(chǎn)酶條件,提高t10, c12-CLA產(chǎn)量,研究突變酶的分離純化條件和酶學性

2、質(zhì),并將其應用于發(fā)酵乳中。
  克隆了兩種亞油酸異構(gòu)酶基因lai-l(ORF1776bp)和lai-p(ORF1275bp)。測序后比對發(fā)現(xiàn),它們與相應的羅伊氏乳桿菌和痤瘡丙酸桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因相似性為100%,說明兩段基因未發(fā)生突變。lai-l與瑞士乳桿菌和加氏乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因相似性為93%,兩段基因彼此之間同源性很低。lai-l編碼591個氨基酸,蛋白命名為LAI-L,分子量為67.9kD,等電點pI=7.14,預測

3、為親水性穩(wěn)定蛋白。它有11個Ser,8個Thr,8個Tyr可能成為蛋白激酶磷酸化的位點,可能是膜上的受體或者定位于膜上;二級結(jié)構(gòu)主要以不規(guī)則卷曲為主達47.88%,α-螺旋占34.86%,β-折疊占17.26%。lai-p編碼424個氨基酸,蛋白命名為LAI-P,分子量為49.0kD,等電點pI=4.81;預測為親水性不穩(wěn)定蛋白。它有3個Ser,4個Thr,7個Tyr可能成為蛋白激酶磷酸化的位點,該蛋白應該是細胞外蛋白;二級結(jié)構(gòu)主要以不

4、規(guī)則卷曲為主達45.28%,α-螺旋占36.32%,β-折疊占18.4%。
  將兩種亞油酸異構(gòu)酶分別在大腸桿菌中表達,表達的蛋白 LAI-L和LAI-P大小約為64kD和55kD;利用易錯 PCR法突變 lai-p,構(gòu)建標簽表達載體pCold-yclai-p-gfp,結(jié)合流式細胞術(shù)篩選正突變菌株,準確率達82.3%(其中7株突變菌的亞油酸異構(gòu)酶的蛋白序列改變了一個氨基酸;4株突變菌的蛋白序列改變了2個氨基酸;M955蛋白序列改變

5、了4個氨基酸,共發(fā)生7個堿基位點的突變)。其最佳誘導時間為18h,最佳誘導劑IPTG濃度為0.2mmol/L,經(jīng)氣相色譜鑒定M955產(chǎn)t10, c12-CLA,產(chǎn)量為68.3±2.1μg/mL。
  突變亞油酸異構(gòu)酶最佳發(fā)酵時間為18h,最佳IPTG誘導濃度為0.2mmol/L,最佳裝液量為20%,最佳培養(yǎng)基初始pH為7,最佳誘導前生物量為OD600=0.4,最佳底物濃度為0.5mg/mL,最佳離子濃度為0.02%的離子。響應曲面

6、法優(yōu)化最佳產(chǎn)酶條件為發(fā)酵時間19.5h,誘導前生物量OD600=0.47和LA濃度0.57mg/mL,亞油酸異構(gòu)酶催化 LA轉(zhuǎn)化為CLA最大量為143.33μg/mL。采用親和層析法對突變酶進行分離純化,最佳流速為0.25 mL/min,最佳上樣量為10 mL,純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測可達到電泳純。
  研究突變酶的酶學性質(zhì)發(fā)現(xiàn):米氏方程為y=0.0224x+0.0786 R2=0.9972,計算得 Km為0.285mg

7、/mL,Vmax為12.72U/mg。酶的最適反應溫度為37℃、溫度穩(wěn)定范圍為0~40℃、最適反應 pH為7.0、pH穩(wěn)定范圍為pH5.0~9.0之間、最佳底物濃度為0.5mg/mL、金屬離子對亞油酸異構(gòu)酶的活性沒有顯著影響。
  將未突變和突變后的痤瘡丙酸桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化到嗜熱鏈球菌中。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌紅霉素的敏感閾值為7.5μg/mL,當甘氨酸濃度為1%、菌體生長至OD600=0.8、轉(zhuǎn)化電壓為1.8kV、質(zhì)粒濃度為

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論