1、目的：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，而AD的一個明顯病理特征是β樣淀粉多肽(amyloidβ,Aβ)在神經(jīng)組織的沉積。Aβ來源于淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)的異常裂解。CCAAT-增強子結合蛋白β(CCAAT enhancer binding proteinsβ,c/EBPβ)是轉錄因子c/EBPs家族的重要成員，對基

2、因的表達調控起著重要的作用。本研究旨在探討轉錄因子c/EBPβ對APP基因啟動子轉錄活性的影響及其對APP基因表達調控的作用機制，進一步探討c/EBPβ在AD發(fā)病過程中的作用，為AD的預防和治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.載體構建：利用分子克隆技術，構建pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-c/EBPβ慢病毒載體和pCDNA3.1-Sp1真核表達載體。
　　2.螢火蟲熒光素酶報告基因檢測實驗(Luci

3、ferase assay)：將c/EBPβ真核表達載體pCDNA3-c/EBPβ與螢火蟲熒光素酶報告質粒pGL3APP170/147共轉染到U87MG細胞中，用Renilla作為內參，通過對螢火蟲熒光素酶活性的分析，確定c/EBPβ蛋白對APP基因啟動子活性的影響。
　　3.實時定量熒光PCR(Real Time PCR,RT-PCR)：用Trizol法提取用c/EBPβ慢病毒和用作對照的空載體病毒感染的HT22細胞的總RNA，進

4、行反轉錄，然后再合成cDNA后進行real-time PCR，檢測c/EBPβ、APP和Sp1基因在轉錄水平上的表達。
　　4.蛋白免疫印跡實驗(Western blotting)：提取用c/EBPβ慢病毒和用作對照的空載體病毒感染的HT22細胞的總蛋白，進行常規(guī)蛋白免疫印漬實驗，檢測c/EBPβ、APP、Sp1及P65蛋白在翻譯水平上的表達。
　　5.免疫共沉淀實驗(Co-Immunoprecipitation,Co-IP

5、)：將真核表達載體c/EBPβ和P300共同轉染到HT22細胞中，48小時后收獲細胞總蛋白，進行免疫共沉淀，確定c/EBPβ蛋白和P300蛋白之間是否有直接的相互作用(physical interaction)。
　　結果：
　　1.載體構建結果：pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-c/EBPβ慢病毒載體和pCDNA3.1-SP1真核表達載體經(jīng)酶切鑒定和測序后，證實所克隆序列及相位完全正確。
　　2.Luc

6、iferase assay實驗結果：c/EBPβ蛋白可上調APP基因啟動子（-170到+147）的活性。
　　3.RT-PCR結果：c/EBPβ過表達組的c/EBPβ、APP和Sp1的RNA表達水平均高于空載對照組的。
　　4.Western blotting實驗結果：c/EBPβ過表達組的c/EBPβ、APP、Sp1和P65的蛋白表達水平均高于空載對照組的。
　　5.Co-IP實驗結果：c/EBPβ蛋白和P300蛋白

7、之間有直接的相互作用。
　　結論：c/EBPβ對APP基因在轉錄和翻譯水平具有上調作用。其作用機制可能有：
　　1.c/EBPβ作為一個轉錄因子，可以調控基因的表達，它對APP基因表達調控的作用機制可能在于其能促進內源性Sp1基因的表達，而Sp1則是APP基因表達的上調因子，它可與啟動子近端GC盒的結合，促進了APP基因的轉錄和表達，c/EBPβ和Sp1在基因表達調控方面有著協(xié)同作用。
　　2.c/EBPβ過表達也能引