1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　1.基于磁性納米顆粒的細(xì)胞、細(xì)菌和病毒核酸提取方法研究
　　核酸提取是進(jìn)行分子生物學(xué)研究和DNA傳感器開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵步驟，核酸提取中殘留的鹽和其它有機(jī)污染物給DNA生物傳感器的開(kāi)發(fā)及病原體檢測(cè)靈敏度等方面提出了挑戰(zhàn)。磁性納米顆粒(Magnetic Nanoparticles，MNPs)是生物醫(yī)學(xué)中研究最多、應(yīng)用最廣的納米材料，有許多特殊性質(zhì)，在代替現(xiàn)有的病原體檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、疾病的體外診

2、斷等方面出現(xiàn)了很多應(yīng)用研究。本論文建立了一種基于磁分離的核酸提取技術(shù)，從血清、細(xì)胞和細(xì)菌中提取高質(zhì)量的核酸，充分利用磁分離的優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)鹽酸胍濃度和pH、乙醇量、洗滌液和洗脫液用量，并用PCR和電泳對(duì)提取的核酸進(jìn)行了驗(yàn)證。另外，用此方法提取病毒血清時(shí)，我們還優(yōu)化了裂解液的鹽濃度和pH。結(jié)果表明，當(dāng)裂解液中GuHCI濃度達(dá)到6 mol/L時(shí)，核酸產(chǎn)量最高，同時(shí)裂解液的pH為4時(shí)提取效果最佳。本研究建立了一

3、種操作簡(jiǎn)單的方法，能夠快速地從細(xì)胞，細(xì)菌和血清中同時(shí)提取DNA和RNA。PCR和RT-PCR結(jié)果也驗(yàn)證了此方法的可靠性。使用納米顆粒可以促進(jìn)使用這種方法在自動(dòng)化核酸提取儀的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，為未來(lái)高通量半自動(dòng)或全自動(dòng)診斷系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　2.基于多重PCR擴(kuò)增和化學(xué)發(fā)光乙肝和丙肝病毒的高靈敏度檢測(cè)
　　乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是全世界威脅人類健康的最主要的疾病之一，感染了這兩種病毒會(huì)導(dǎo)致慢性肝炎，肝硬

4、化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生。因此對(duì)這一感染的早期診斷對(duì)疾病的治療以及抑制疾病傳播至關(guān)重要。目前的分子檢測(cè)系統(tǒng)不但價(jià)格昂貴，而且檢測(cè)靈敏度較低。因此，研發(fā)一種高靈敏且成本低廉的肝炎病毒診斷方法及早檢測(cè)和治療肝炎病毒，在全世界范圍尤其是發(fā)展中國(guó)家有著非常迫切的需求。本研究提出了一種通過(guò)結(jié)合磁分離、一步法逆轉(zhuǎn)錄多重PCR和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏、可自動(dòng)化檢測(cè)臨床樣品乙肝和丙肝病毒的方法。對(duì)可能影響PCR擴(kuò)增和化學(xué)發(fā)光的因素，如引物退火溫

5、度，探針與目的序列雜交溫度，雜交時(shí)間和探針濃度等進(jìn)行了探索。多重PCR的退火溫度被確定為58℃，HBV探針雜交的最佳溫度為45℃，HCV探針雜交的最佳在溫度為55℃，最適探針濃度為5μM。當(dāng)雜交在30 min時(shí)記錄得到最大的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。該方法成功地檢測(cè)到10拷貝/mL HBV和HCV病毒，有很高的特異性和靈敏度，可滿足臨床病毒檢測(cè)需要。
　　3.基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、化學(xué)發(fā)光的病毒檢測(cè)方法初探
　　目前臨床上用于病毒檢測(cè)的方

6、法有很多，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)以及化學(xué)發(fā)光(CL)檢測(cè)等。在這些檢測(cè)技術(shù)中，基于核酸雜交的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)乙肝、丙肝和艾滋病毒的臨床檢測(cè)。然而傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)不僅需要通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)得到有效的目標(biāo)DNA，以便用于雜交，也需要長(zhǎng)時(shí)間復(fù)雜的熱循環(huán)過(guò)程和昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，這些方面的不足使得這一方法并不適合于醫(yī)療條件相對(duì)較低的社區(qū)

7、醫(yī)院或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等情況。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）能夠讓核酸在等溫的條件下快速且高特異性地進(jìn)行核酸擴(kuò)增，避免了PCR長(zhǎng)時(shí)間復(fù)雜的熱循環(huán)過(guò)程和昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器。本論文探索了一種基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的辦法檢測(cè)RNA病毒。在LAMP擴(kuò)增中加入biotin-11-dUTP使擴(kuò)增產(chǎn)物帶上生物素標(biāo)記，再經(jīng)過(guò)與特異性探針雜交，最后利用ALP-AMPPD化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系判斷樣本中是否含有病毒核酸，以達(dá)到

8、病原體檢測(cè)目的。本論文優(yōu)化了LAMP擴(kuò)增和探針雜交的相關(guān)條件，如LAMP反應(yīng)溫度、雜交時(shí)間、雜交溫度、探針濃度等。確定了反應(yīng)溫度為63℃時(shí)對(duì)HA和NA基因的擴(kuò)增效率最佳;探針濃度為10μM，雜交時(shí)間為50 min時(shí)對(duì)于HA和NA探針雜交效果最佳;然而，兩種基因探針的最適雜交溫度略有不同，HA基因最佳雜交溫度為50℃，NA探針最佳雜交溫度為55℃。最后，通過(guò)靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，我們得到本方法可以檢測(cè)出103拷貝/mL的H7N9-RNA。本方法