1、拷貝數(shù)變異(Copy Number Variations，CNVs)是一種大小從1 kb到幾個Mb范圍內(nèi)的DNA片段多態(tài)性，形式包括缺失、插入、重復以及復雜的多位點突變等。CNVs廣泛分布于基因組中，是遺傳變異的主要形式之一，對基因表達、表型變異以及基因劑量的改變都有很大影響，可以引發(fā)各種復雜的疾病。對CNVs的研究可以闡述遺傳疾病的分子機制，尋找用于基因診斷和產(chǎn)前診斷的分子標記，為疾病的分子診斷和新治療方法的開發(fā)提供科學依據(jù)。近年來，

2、隨著納米技術的迅速發(fā)展，納米材料的應用為生物醫(yī)學的研究和發(fā)展提供了新的技術和手段。磁性納米顆粒(Magnetic Nanoparticles，MNPs)是納米材料的重要組成部分，由于其具有高表面積、易分離以及良好的生物相容性等特點，目前已被廣泛地應用于生物信號檢測方面。另外，化學發(fā)光(Chemiluminescence，CL)技術因具有較高的靈敏度、特異性和準確度以及儀器要求簡單等優(yōu)點，成為了生物分析研究與發(fā)展的重要工具。本論文研究結(jié)合

3、磁性納米顆粒和化學發(fā)光技術的優(yōu)點，建立了一種快速、靈敏和實用的核酸定量新技術，并用于CNVs的檢測，具體研究內(nèi)容包括:
　　1.溶劑熱法制備磁性納米復合顆粒
　　通過溶劑熱法制備了粒徑均勻、分散性良好的納米Fe3O4顆粒，在顆粒表面包被上一層SiO2組裝成Fe3O4/SiO2磁性納米復合顆粒，表征結(jié)果表明該納米復合顆粒為具有明顯核殼結(jié)構(gòu)的球形實心顆粒，粒徑約為450nm。在顆粒的SiO2殼層表面進行了功能化基團修飾，制成了可

4、以結(jié)合氨基化捕獲探針的羧基化MNPs。
　　2.基于磁性納米顆粒、化學發(fā)光技術以及引物延伸法的核酸定量檢測方法研究
　　拷貝數(shù)變異的根本原因為基因劑量發(fā)生了變化，因此對CNVs的檢測和分析即建立在核酸定量分析的基礎上。近年來，基于磁性納米技術的核酸分離與檢測技術得到了快速發(fā)展，本研究以Fe3O4/SiO2磁性復合顆粒為固相載體，以人工合成的單鏈模擬片段(GAPDH，，GSTT1，GSTM1)為檢測目標，通過引物一次延伸法和化

5、學發(fā)光檢測技術，擬建立一種新的核酸定量方法。通過在MNPs表面修飾的捕獲探針，對引物一次延伸得到的含有biotin-dUTP的特異性片段進行雜交捕獲，然后與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)結(jié)合，最后加入3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-羥基)苯-1，2-二氧雜環(huán)丁烷磷酸(3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)

6、 phenyl-1,2-dioxetane,AMPPD)，通過化學發(fā)光反應體系實現(xiàn)快速特異性檢測，初步結(jié)果表明該方法在核酸檢測方面具有良好的特異性和靈敏度。隨后對化學發(fā)光反應體系相關實驗條件進行了優(yōu)化，得出了最佳的顆粒羧基化修飾濃度、氨基化探針修飾濃度、顆粒用量以及雜交溫度。在最優(yōu)化的實驗條件下進行了模擬核酸的定量分析，結(jié)果顯示在模板濃度為0.625-10μM的范圍內(nèi)，CL信號與三個基因的模板濃度均呈現(xiàn)出良好的線性關系，表明該方法可以在

7、一定范圍內(nèi)進行核酸的定量分析，但由于較高的檢測限并不適用基因組DNA樣本的檢測，需要進一步地提高靈敏度，拓寬檢測信號的線性范圍。
　　3.基于磁性納米顆粒、化學發(fā)光以及探針連接依賴擴增技術的核酸定量檢測方法的研究
　　為了實現(xiàn)檢測信號的放大以及能夠在基因組DNA中進行核酸定量檢測，我們以Fe3O4/SiO2磁性復合顆粒為固相雜交載體，以化學發(fā)光技術為檢測手段，結(jié)合探針連接依賴的擴增技術發(fā)展了一種新的核酸定量檢測方法。通過一對

8、末端帶有通用引物的相鄰探針同時與模板片段雜交，并在DNA連接酶的作用下連接成可擴增的特異性片段，利用通用引物擴增得到的目標產(chǎn)物可被MNPs表面修飾的探針捕獲，最后通過ALP-AMPPD反應體系進行化學發(fā)光檢測。針對PCR擴增產(chǎn)物檢測的需要，對MNPs-CL體系進行了實驗條件的優(yōu)化:MNPs的最佳羧基化修飾濃度為1 mM;最佳修飾探針為含有手臂分子的3'端結(jié)合于MNPs的3'NH2-(T)15探針，最佳探針修飾濃度為10μM;最佳MNPs

9、用量為300μg; DNA捕獲探針的最佳雜交溫度為52℃;探針連接依賴的PCR擴增最佳循環(huán)數(shù)為25;雜交體系中最佳雜交產(chǎn)物量為4μL。在最優(yōu)化的實驗條件下進行了模擬核酸定量檢測和分析，得到了檢測限10fM，在初始模板濃度為0.02-200 pM的范圍內(nèi)，CL信號值與模板濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系(R2=0.987)。研究結(jié)果表明該方法具有較高的特異性和靈敏度，為進一步實現(xiàn)基因組DNA的定量檢測和基因拷貝數(shù)變化的分析提供了技術基礎。

10、r>　　4.基于磁性納米顆粒、化學發(fā)光以及探針連接依賴的擴增技術的檢測CNVs的方法研究
　　雖然前人在研究MNPs-CL核酸傳感器的過程中，同樣結(jié)合了磁分離技術和酶促化學發(fā)光信號放大技術，但他們檢測的靶序列大都是人工合成的模擬單鏈小片段核酸分子，而在基因組DNA中對長鏈、雙鏈DNA的檢測卻鮮有報道。為了進行方法學評估，驗證其實用性，我們利用已建立的基于MNPs-CL系統(tǒng)和探針連接依賴的擴增技術的核酸定量檢測方法對基因組DNA中的

11、CNVs位點進行了定量檢測和分析。通過對整合到質(zhì)粒DNA中的模擬基因序列的拷貝數(shù)變化分析，結(jié)果初步顯示該方法在檢測基因組中目標基因拷貝數(shù)變化方面具有較好的特異性。然后對40個人類基因組DNA樣本（包括了男性、女性以及染色體21三體綜合征樣本）中的6個目標基因進行了定量檢測，通過與內(nèi)參基因的比較分析得出拷貝數(shù)的變化，結(jié)果顯示僅有1個基因的拷貝數(shù)存在不確定性。而作為對照方法的多重連接探針依賴的擴增技術(Multiplex Ligation-

12、dependent ProbeAmplification，MLPA)的檢測結(jié)果，有2個基因的拷貝數(shù)偏離了期望值，表明MNPs-CL系統(tǒng)檢測的準確度可與目前的MLPA技術相媲美，可以適用于CNVs位點分析，為研究CNVs與疾病的相關性提供了新的技術和手段。
　　5.基于金磁納米復合顆粒和熒光技術的核酸定量檢測方法的研究
　　在摸索新的核酸定量檢測方法的過程中，我們還利用金磁納米復合顆粒(Gold-coated Magnetic

13、 Nanocomposites，GMNPs)和熒光進行定量檢測方法的研究。利用實驗室自制的低熒光背景的Fe3O4@SiO2@Au(GMNPs)作為固相雜交載體，以人工合成的單鏈模擬片段為檢測目標，以熒光掃描技術為檢測手段，分別結(jié)合引物在位延伸法和探針連接依賴的擴增技術探索新的核酸定量檢測方法。對兩個檢測體系的相關實驗條件進行了優(yōu)化，包括引物在位延伸體系的顆粒用量、熒光雜交探針濃度和雜交溫度以及探針連接擴增體系的Ligase buffer