1、本研究以開(kāi)發(fā)新型抗生素替代品為目的，從研究動(dòng)物源抗菌肽對(duì)緩解腸道炎癥和改善腸道物理屏障功能的角度出發(fā)，在本課題組前期研究工作的基礎(chǔ)上篩選出兩種抗菌活性強(qiáng)、細(xì)胞毒性低的動(dòng)物源抗菌肽C-BF與pBD2，首先以DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎為模型，系統(tǒng)研究了抗菌肽C-BF與pBD2對(duì)腸道炎癥的緩解作用及對(duì)腸上皮物理屏障功能的改善效果，進(jìn)一步通過(guò)體外試驗(yàn)研究了抗菌肽緩解腸道炎癥及改善腸道物理屏障的途徑，旨在揭示其發(fā)揮上述功能的分子機(jī)制。主要研究結(jié)

2、果如下:
　　試驗(yàn)一、抗菌肽對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥影響的研究
　　本試驗(yàn)通過(guò)建立葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，通過(guò)表觀癥狀、機(jī)體炎癥水平及結(jié)腸炎癥水平三個(gè)方面研究了抗菌肽C-BF和pBD2對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠腸道炎癥的影響:
　　(1) DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎模型的建立及抗菌肽對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠表觀癥狀的影響:
　　在DSS誘導(dǎo)引發(fā)的潰瘍性結(jié)腸炎模型中，注射兩種抗菌肽對(duì)小鼠表觀癥狀的改善起

3、著積極作用，為后續(xù)深入的在分子層面開(kāi)展研究提供了依據(jù);
　　(2)抗菌肽對(duì)小鼠全身炎癥水平的影響:在全血中主要免疫細(xì)胞比例方面，DSS顯著下調(diào)了全血中巨噬細(xì)胞和B、T淋巴細(xì)胞的比例，在一定程度上對(duì)機(jī)體先天及后天免疫功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用;DSS顯著提高了血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、 IL-8和IL-10的濃度(p＜0.05)，抗菌肽可通過(guò)下調(diào)炎性因子的分泌緩解機(jī)體炎癥;
　　(3)抗菌肽對(duì)小鼠結(jié)腸炎癥水平的影響:

4、在結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤(rùn)方面，DSS誘導(dǎo)后炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著增加(p＜0.05)，而注射抗菌肽C-BF和pBD2后，顯著改善了結(jié)腸組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)狀況(p＜0.05)，說(shuō)明上述兩種抗菌肽可通過(guò)抑制入侵結(jié)腸組織炎性細(xì)胞的數(shù)量減緩腸道炎癥;在小鼠結(jié)腸mCRAMP表達(dá)豐度方面:DSS處理顯著提高了結(jié)腸mCRAMP的表達(dá)豐度，而注射抗菌肽C-BF與pBD2后，mCRAMP的表達(dá)豐度與DSS組比顯著降低抗菌肽對(duì)結(jié)腸炎癥水平具有明顯緩解作用;在結(jié)腸炎性

5、相關(guān)酶活方面:DSS誘導(dǎo)組INOS及COX-2的濃度顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)，抗菌肽可通過(guò)下調(diào)炎性相關(guān)酶濃度的方式緩解腸道炎癥。
　　試驗(yàn)二、抗菌肽緩解腸道炎癥的機(jī)制研究
　　在試驗(yàn)一發(fā)現(xiàn)抗菌肽C-BF與pBD2對(duì)改善DSS誘導(dǎo)小鼠表觀癥狀及緩解腸道炎癥有一定效果的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步從炎性相關(guān)信號(hào)通路炎癥水平、巨噬細(xì)胞吞噬功能及巨噬細(xì)胞極化功能三個(gè)方面對(duì)其緩解腸道炎癥的機(jī)制進(jìn)行探討:
　　(1)抗菌肽緩解DSS

6、誘導(dǎo)小鼠腸炎的信號(hào)通路研究:在緩解腸道炎癥信號(hào)通路方面，在DSS誘導(dǎo)下，會(huì)引起與炎性因子分泌相關(guān)的信號(hào)NF-κB(p65)及c-jun的磷酸化水平顯著提高(p＜0.05)，抗菌肽C-BF和pBD2可能是通過(guò)抑制NF-κB(p65)而非c-jun的磷酸化水平緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥;在小鼠巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平方面:抗菌肽C-BF和pBD2均可顯著降低LPS導(dǎo)致的RAW264.7細(xì)胞分泌上清中TNF-α、PGE2及NO濃度的異常升高

7、(p＜0.05)，抗菌肽C-BF和pBD2均可顯著降低RAW264.7細(xì)胞的炎癥水平;在緩解小鼠巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路方面:抗菌肽C-BF和pBD2可通過(guò)抑制NF-κB相關(guān)信號(hào)通路的磷酸化水平緩解炎癥。
　　在上述研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽C-BF和pBD2具有緩解炎癥的功能及其可能的信號(hào)通路后，進(jìn)一步研究了其是否對(duì)正常巨噬細(xì)胞具有調(diào)控功能及其可能的分子機(jī)制:
　　(2)抗菌肽對(duì)豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響及其機(jī)制:在對(duì)豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的影

8、響方面，抗菌肽C-BF和pBD2對(duì)豬巨噬細(xì)胞的吞噬功能均具有促進(jìn)作用，其中抗菌肽C-BF具有劑量依賴(lài)效應(yīng);在促進(jìn)豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的機(jī)例方面:表明TLR2和TLR4干擾后，抗菌肽C-BF和pBD2對(duì)豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用明顯減弱，說(shuō)明上述兩種抗菌肽促進(jìn)豬巨噬細(xì)胞吞噬功能可能是通過(guò)TLR2/4信號(hào)途徑介導(dǎo)，上述結(jié)果提示抗菌肽緩解腸道炎癥的另一機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬功能，減少感染腸道病原菌數(shù)量實(shí)現(xiàn);
　　(3)抗

9、菌肽協(xié)同誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞極化分型的作用:在豬巨噬細(xì)胞極化分型的影響方面，抗菌肽C-BF和pBD2均可通過(guò)激活STAT-6的磷酸化水平協(xié)同誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞向M2型分化，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其協(xié)同誘導(dǎo)后上調(diào)了M2型巨噬細(xì)胞表面特征分子的基因表達(dá)水平，且抗菌肽C-BF的協(xié)同誘導(dǎo)效果優(yōu)于抗菌肽pBD2。該結(jié)果從影響巨噬細(xì)胞分型的角度揭示了抗菌肽C-BF和pBD2緩解炎癥的又一分子機(jī)制。
　　試驗(yàn)三、抗菌肽對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道物理屏障的保護(hù)功

10、能研究
　　本研究從腸道形態(tài)、腸道電生理變化及結(jié)腸上皮凋亡與緊密連接蛋白表達(dá)三個(gè)方面研究了抗菌肽對(duì)小鼠腸道物理屏障的保護(hù)功能:
　　(1)抗菌肽對(duì)DSS致小鼠腸道形態(tài)損傷的影響:在結(jié)腸形態(tài)方面，采集小鼠腸道樣品，制作H&E染色切片對(duì)結(jié)腸形態(tài)進(jìn)行觀察，從腸道形態(tài)來(lái)看，與對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)組小鼠結(jié)腸上皮受到嚴(yán)重的破壞，腸絨毛結(jié)構(gòu)雜亂無(wú)章，且用肉眼已完全無(wú)法分辨其腸上皮粘膜層結(jié)構(gòu)，同時(shí)粘膜下層水腫嚴(yán)重，加入抗菌肽C-BF和pB

11、D2處理組小鼠結(jié)腸絨毛結(jié)構(gòu)與DSS組相比發(fā)生明顯改變，腸絨毛間邊界清晰，具有完整的粘膜層形態(tài)結(jié)構(gòu)，且粘膜下層水腫情況有了明顯改善;結(jié)果提示抗菌肽可明顯改善DSS導(dǎo)致的結(jié)腸上皮形態(tài)破壞;
　　(2)抗菌肽對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸電生理學(xué)變化的影響:與正常對(duì)照組比較，DSS誘導(dǎo)組小鼠血清中FITC-dextran濃度顯著提高(p＜0.05)，而注射C-BF后血清中FITC-dextran濃度與DSS組比較顯著下調(diào)(p＜0.05)，注射pB

12、D2后血清中FITC-dextran濃度有下降的趨勢(shì)，上述結(jié)果提示抗菌肽在不同程度上降低了DSS致結(jié)腸通透性增加;在結(jié)腸垮上皮電阻值方面:通過(guò)Ussing champer測(cè)定各組結(jié)腸粘膜跨上皮電阻值變化，結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)組小鼠跨上皮電阻值明顯低于40Ω，而不同抗菌肽處理組小鼠跨上皮膜電阻值均穩(wěn)定在40Ω以上，結(jié)果提示抗菌肽對(duì)于維持結(jié)腸電生理學(xué)的穩(wěn)定狀態(tài)具有積極作用;
　　(3)抗菌肽對(duì)結(jié)腸上度細(xì)胞凋亡及緊密連接蛋白表達(dá)的影響:D

13、SS誘導(dǎo)的小鼠其結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加(p＜0.05)，而在DSS的誘導(dǎo)過(guò)程中，加入抗菌肽C-BF和pBD2處理的組別，其結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)與單獨(dú)用DSS誘導(dǎo)組相比顯著降低(p＜0.05)，結(jié)果說(shuō)明抑制結(jié)腸上皮凋亡水平可能是緩解跨上皮電阻值下降，維持腸道形態(tài)正常的原因之一;在緊密連接蛋白及黏蛋白表達(dá)方面:通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)各組結(jié)腸組織緊密連接蛋白及黏蛋白的基因表達(dá)水平，結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，DSS處理組顯著降低了緊密連接蛋

14、白和黏蛋白的表達(dá)水平(p＜0.05)，而加入抗菌肽處理的組別，提高了緊密連接蛋白的表達(dá)水平，其中抗菌肽C-BF的促進(jìn)效果優(yōu)于pBD2。上述研究結(jié)果提示抗菌肽可通過(guò)改善緊密連接蛋白的表達(dá)，維持腸道物理屏障功能正常。
　　試驗(yàn)四、抗菌肽保護(hù)腸道物理屏障的機(jī)制研究
　　在上述研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽C-BF與pBD2對(duì)改善腸道物理屏障具有明顯效果的基礎(chǔ)上，本研究從腸細(xì)胞單層跨上皮電阻值、細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)及腸細(xì)胞形態(tài)三個(gè)方面對(duì)其保護(hù)腸道物理

15、屏障的機(jī)制進(jìn)行探討:
　　(1)抗菌肽對(duì)DSS致腸上皮細(xì)胞單層跨膜電阻值降低的影響:在Caco-2細(xì)胞單層跨膜電阻值方面，本研究模擬體內(nèi)腸上皮組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，體外培養(yǎng)人Caco-2細(xì)胞至單層分化狀態(tài)，用DSS進(jìn)行細(xì)胞模型的建立，研究結(jié)果表明DSS單獨(dú)處理組Caco-2細(xì)胞單層跨上皮電阻值顯著低于對(duì)照組(p＜0.05)，而抗菌肽C-BF和pBD2預(yù)處理的組別，其跨上皮電阻值與對(duì)照組接近;
　　(2)抗菌肽對(duì)Caco-2細(xì)胞間緊密

16、連接結(jié)構(gòu)及緊密連接蛋白表達(dá)的影響:在Caco-2細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)方面，通過(guò)透射電鏡對(duì)培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞單層緊密連接結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，研究結(jié)果表明DSS可使本來(lái)結(jié)構(gòu)完整清晰的緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞，而用抗菌肽C-BF和pBD2預(yù)處理的組別，其緊密連接結(jié)構(gòu)完整，說(shuō)明維持緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性是抗菌肽緩解DSS致跨上皮電阻值降低的機(jī)制之一;在緊密連接蛋白的表達(dá)方面:通過(guò)western-blot和qRT-PCR分析抗菌肽對(duì)DSS致緊密連接蛋白表達(dá)下

17、調(diào)的影響，結(jié)果表明與正常對(duì)照組比較，DSS處理組ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(p＜0.05)，而加入抗菌肽預(yù)處理后，上述三個(gè)緊密連接蛋白的表達(dá)水平均有不同程度升高，提示抗菌肽可促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)維持緊密連接結(jié)構(gòu)完整性;
　　(3)抗菌肽對(duì)單個(gè)上皮細(xì)胞形態(tài)的影響:在單個(gè)Caco-2細(xì)胞形態(tài)方面，通過(guò)掃描電鏡觀察抗菌肽對(duì)DSS致單個(gè)Caco-2細(xì)胞形態(tài)破壞的影響，結(jié)果表明DSS處理組Ca

18、co-2細(xì)胞表面微絨毛形態(tài)受到嚴(yán)重破壞，呈光滑狀，從多細(xì)胞視野中甚至可以看到一些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生瓦解或呈現(xiàn)碎片樣，而在DSS刺激前加入抗菌肽C-BF和pBD2預(yù)處理的各組，其Caco-2細(xì)胞表面徽絨毛形態(tài)與對(duì)照組接近，提示抗菌肽對(duì)單個(gè)上皮細(xì)胞的正常生長(zhǎng)同樣具有保護(hù)作用。
　　綜上所述，本研究通過(guò)DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型發(fā)現(xiàn)抗菌肽C-BF和pBD2具有顯著緩解腸道炎癥和改善腸道物理屏障的功能，并揭示了其緩解炎癥和改善屏障功能的內(nèi)在