1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)，簡稱青蟹，是我國東南沿海重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖蟹類。迄今已有報道抗菌肽在青蟹抵抗海洋環(huán)境中病原微生物的入侵感染方面具有重要作用?？咕膹V泛存在于自然界的生物中，是動物先天性免疫系統(tǒng)中的重要組分。自1996年甲殼類抗菌肽首次在岸蟹（Carcinus maenas）中報道以來，已有幾種抗菌肽在蟹類血淋巴系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，它們是蟹類重要的免疫因子。因此，青蟹中新抗菌肽的揭示對于深入闡明其免疫機

2、制及其在復雜的環(huán)境中健康生存具有重要的科學意義和應用價值。本實驗室在前期研究中篩選到一個新的與蛛型互愛蟹(Hyas araneus)Hyastatin同源性較高的基因序列，進一步分析發(fā)現(xiàn)其為一種新的抗菌肽并命名為SpHyastatin。本文對SpHyastatin的表達特性、基因調(diào)控、抗菌活性與機制以及細菌感染后的保護力等進行了深入研究，具體研究結(jié)果如下:
　　1.闡明了青蟹SpHyastatin的編碼序列和基因組結(jié)構(gòu)。通過RAC

3、E技術及序列拼接獲得777 bp的全長SpHyastatin cDNA序列(GenBank登錄號:JX228177)，其中開放閱讀框編碼131個氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)，SpHyastatin的編碼區(qū)由信號肽、N端脯氨酸富集區(qū)(proline-rich domain，PRD)以及C端半胱氨酸富集區(qū)(cysteine-rich domain，CRD)組成。基因組全長1488 bp，包括兩個外顯子和一個內(nèi)含子(741 bp)，內(nèi)含子中含有TAG

4、或GAA三堿基多次重復的微衛(wèi)星序列。
　　2.揭示了SpHyastatin在正常組織、不同發(fā)育階段、不同類型血淋巴細胞中的表達特性。SpHyastatin在血淋巴細胞中表達量最高，其次為甲殼下皮層，其它組織器官中表達微弱。檢測三種青蟹血淋巴細胞，SpHyastatin在半顆粒細胞中轉(zhuǎn)錄豐度最高。在胚胎發(fā)育早期階段（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）表達水平較低，從胚胎Ⅴ期至大眼幼體期表達量顯著升高。同時與已知6種抗菌肽基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)SpHya

5、statin在青蟹大眼幼體、仔蟹(10-20mg)、仔蟹(40±5g)和成蟹(300 g)等四個不同發(fā)育階段中始終保持高水平的表達，預示該抗菌肽可能在整個發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要的作用。
　　3.檢測了脂多糖（lipopolyaccharides，LPS）刺激和副溶血弧菌感染后青蟹SpHyastatin基因在不同組織器官中的表達特性。LPS刺激12h后，SpHyastatin基因在青蟹免疫器官（血淋巴細胞、鰓）和消化器官（中腸）中都

6、呈下調(diào)表達，分別為對照組的0.36、0.18和0.35倍(P＜0.05)。隨刺激時間延長，SpHyastatin基因的表達水平逐漸升高，48 h在中腸及96 h在血淋巴細胞和鰓中表達量最高。與LPS刺激相似，副溶血弧菌感染24 h后SpHyastatin基因在血淋巴細胞和中腸中的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，分別為對照組的0.38和0.17倍(P＜0.05)，感染96 h后轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，分別為對照組的6.07倍(P＜0.05)和6.10倍(P＜

7、0.01)，但在鰓中呈現(xiàn)出不同的表達變化趨勢。
　　4.分析發(fā)現(xiàn)NF-κB結(jié)合位點是SpHyastatin啟動子區(qū)域中關鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。通過基因步移技術擴增獲得576 bp SpHyastatin基因上游調(diào)控序列，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)及鯉魚上皮瘤細胞(endothelial progenitor cells，EPC)和人宮頸癌細胞(human cervical cancer cells，Hela)研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理。檢測結(jié)果顯

8、示，當刪除SpHyastatin5'側(cè)翼-107 bp至-69 bp區(qū)域后，重組子pGL-69/+33的相對熒光強度顯著下降，分析發(fā)現(xiàn)-107 bp至-69 bp區(qū)域中存在假定NF-κB結(jié)合位點。與pGL3-567/+33轉(zhuǎn)錄活性相比，NF-κB結(jié)合位點的三堿基突變和刪除突變重組子的轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，表明該結(jié)合元件對SpHyastatin的轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用。此外，LPS可顯著增強SpHyastatin基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，但對NF-κB

9、結(jié)合位點突變的重組子無明顯誘導作用，提示LPS可能通過NF-κB結(jié)合位點調(diào)控SpHyastatin基因的轉(zhuǎn)錄。本試驗將有助于深入研究LPS刺激引起抗菌肽基因的表達變化機制。
　　5.闡明SpHyastatin的抗菌活性和抗菌功能域。利用獲得的畢赤酵母（Pichiapastoris）表達產(chǎn)物SpHyastatin和PRD進行抗微生物活性檢測。研究發(fā)現(xiàn)，SpHyastatin表達產(chǎn)物具有廣譜抗菌活性，對溶壁微球菌(Micrococcu

10、slysodeikticus Fleming)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等革蘭氏陽性菌以及熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)等革蘭氏陰性菌

11、均具有較強的抑殺作用（0.63-10μmol/L）。殺菌動力學曲線顯示，SpHyastatin與金黃色葡萄球菌共孵5h能夠殺死近90％的細菌，共孵6h殺菌指數(shù)可達到100％。PRD能夠有效抑制金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌、施氏假單胞菌以及熒光假單胞菌的生長(MIC=2.5-5μmol/L)。而CRD只對熒光假單胞菌、藤黃微球菌、谷氨酸棒桿菌具有微弱的抑菌活性(MIC=25-37μmol/L)，說明其抗菌活性部位主要在PRD。
　　6

12、.揭示SpHyastatin對不同種類的病原菌具有不同的抗菌機理。ELISA分析結(jié)果顯示，SpHyastatin蛋白在濃度為1.25μg/mL時即可結(jié)合LPS與脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA); Western-blot結(jié)果表明SpHyastatin和PRD具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性，而CRD無此功能;碘化丙啶(propidium iodide，PI)攝取試驗結(jié)果顯示，與SpHyastatin蛋白孵育2h后，幾乎所有的微

13、生物細胞均具有紅色熒光信號，表明其細胞通透性發(fā)生改變;掃描電子顯微鏡(scanning electronmicroscope，SEM)圖片顯示，SpHyastatin蛋白處理后的金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌以及畢赤酵母的細胞膜表面變得粗糙，細胞結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞;采用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy, CLSM）觀察蛋白與微生物互作后的定位情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌和畢赤酵母中

14、，SpHyastatin蛋白能夠定位于細胞膜，細胞質(zhì)無熒光信號，而在熒光假單胞菌的細胞膜和細胞質(zhì)中均能檢測到SpHyastatin蛋白。
　　7.青蟹活體試驗證明SpHyastatin可提高青蟹的存活率。用SpHyastatin表達產(chǎn)物單獨注射青蟹1h，后再經(jīng)副溶血弧菌感染192 h，發(fā)現(xiàn)該抗菌肽可顯著提高青蟹的存活率(P＜0.05);此外，SpHyastatin表達產(chǎn)物與副溶血弧菌共注射青蟹120 h，發(fā)現(xiàn)SpHyastatin

15、可延遲青蟹的死亡，青蟹的半數(shù)致死時間可從10h延遲到30h，表明SpHyastatin具有免疫保護作用。
　　8.在細菌感染下SpHyastatin的存在會影響其它免疫基因的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，青蟹注射副溶血弧菌后，其Toll通路的相關基因(Spaetzle、SpToll、Cactus、Dorsal、Relish)、抗氧化酶相關基因(SOD、CAT、GPx)及Lysozyme表達水平顯著升高，而SpHyastatin與副溶血弧菌共