1、擬穴青蟹是我國重要的海水養(yǎng)殖蟹類，具有較大的經濟價值，但在人工養(yǎng)殖過程中容易受細菌、病毒的感染而導致其繁殖和養(yǎng)殖過程中存活率較低，從而給擬穴青蟹的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。如何通過提高擬穴青蟹自身的免疫力來抵抗日益嚴重的病害己成為目前蟹類養(yǎng)殖業(yè)中一個亟待解決的問題。本論文擬從分子生物學的角度，通過研究擬穴青蟹生長過程中及細菌感染下免疫相關的基因表達譜變化規(guī)律，探討這些基因在青蟹免疫過程中的作用，為解決病害問題提供必要的理論基礎。
　

2、　 本研究通過構建cDNA文庫，借助cDNA末端快速擴增(RACE)和熒光定量PCR技術對與擬穴青蟹免疫相關的基因進行克隆和表達模式分析，利用分子生物學和生物信息學方法進行分析和研究，為解決擬穴青蟹的免疫研究提供基礎資料。主要研究結果總結如下：
　　 1.生物體中鐵蛋白是一種重要的儲存鐵的蛋白。運用克隆測序和SMART技術從擬穴青蟹的肝胰腺cDNA文庫中分離得到了一條cDNA全長序列，通過Mega軟件比對發(fā)現，這條cDNA序列

3、與其他物種鐵蛋白基因之間具有較高的同源性，經綜合分析確定為鐵蛋白基因(SpFer)。擬穴青蟹鐵蛋白基因由767bp組成，包含一個513bp的開放閱讀框，它編碼一個分子量約為19440道爾頓，等電點為5.24的蛋白。該基因編碼的鐵蛋白與凡納濱對蝦的鐵蛋白序列有83％相似度。運用Quantitativereal-timePCR技術，研究了鐵蛋白基因在擬穴青蟹的肌肉、心臟、眼柄、肝胰腺、精巢、卵巢等各個不同組織及從溞狀幼體Z1-Z5、大眼幼體

4、和仔蟹Ⅰ期7個不同發(fā)育階段的時空表達差異，檢測的各個組織以及不同的發(fā)育時期鐵蛋白基因均有表達，其中心臟和肝胰腺中鐵蛋白基因的表達量最高，精巢中表達量最低，在不同發(fā)育時期溞狀幼體Z1期SpFer表達量最高，大眼幼體時期表達量最低。鐵蛋白通過調節(jié)生物體內鐵的含量，抵抗外界損傷，提高機體免疫力，因此，本實驗為深入研究擬穴青蟹鐵蛋白基因的結構和功能奠定基礎。
　　 2.C型凝集素是一類能專一識別糖類化合物，參與生物內在免疫反應的蛋白。運

5、用克隆測序和SMART技術從擬穴青蟹幼體的cDNA文庫中分離得到了兩條C型凝集素(SpLec1和SpLec2)的cDNA全長序列。SpLec1由756bp組成，編碼165個氨基酸，預測蛋白分子量約為18250道爾頓。SpLec2由834bp組成，編碼由186個氨基酸組成，分子量約為19700道爾頓的蛋白。運用熒光定量PCR技術研究了C型凝集素基因在擬穴青蟹的肝胰腺、精巢、卵巢、肌肉、眼柄、鰓、血淋巴等各個不同組織，溞狀幼體Z1-Z55個

6、不同發(fā)育階段的時空表達差異。分析結果表明SpLec在血淋巴、肝胰腺、精巢、肌肉中均有表達，其中在血淋巴中表達水平最高。在不同的幼體發(fā)育時期SpLec均有表達，其中溞狀幼體Z4期表達水平最高，Z5期表達水平最低。用副溶血性弧菌對大眼幼體處理，發(fā)現開始時SpLec的表達量較低，浸泡3h時表達量上升至最高點，之后回歸到原來水平。C型凝集素參與大量的先天免疫防御和細胞連接反應，本研究對了解擬穴青蟹的免疫系統(tǒng)具有重要的參考價值。
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7、.熱激活蛋白HSP90是一種高度保守的蛋白，具有穩(wěn)定蛋白結構、參與機體免疫、細胞周期調控的作用，在維持機體的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。采用RACE-PCR技術從擬穴青蟹中克隆到熱激活蛋白HSP90基因的cDNA全序列(SpHSP90)。SpHSP90基因cDNA全長2677bp，包含428bp的3’非編碼區(qū)域(UTR)和83bp5'非編碼區(qū)，開放閱讀框(ORF)為2166bp，預測編碼一個分子量為82710道爾頓，等電點為4.62的蛋白。其N

8、端具有HSP90保守的ATPase結構，C端具有HSP90家族保守的序列MEEVD。與三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)相比較，相似性高達98％。運用熒光定量PCR技術研究了HSP90基因在擬穴青蟹肝胰腺、精巢、卵巢、肌肉、眼柄、鰓、血淋巴等各個不同組織中的表達情況，分析結果表明除眼柄外，SpHSP90在上述不同組織中均有表達，其中在心臟和肝胰腺中表達水平較高。分別用副溶血性弧菌和滅活的副溶血性弧菌注射成體擬穴

9、青蟹，結果發(fā)現，SpHSP90mRNA表達量在感染副溶血性弧菌后明顯提高，6小時后達到最高水平，活菌組的表達量明顯高于滅活菌組的表達量(P<0.01)。HSP90可能在擬穴青蟹的免疫和抗菌過程中具有重要作用。
　　 綜上所述，本研究克隆得到了3個與擬穴青蟹免疫相關基因的cDNA全長，運用Ouantitativereal-timePCR技術研究了它們在擬穴青蟹不同組織以及不同發(fā)育時期的差異表達模式，為擬穴青蟹的免疫研究提供必要的理