1、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖蟹類,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,但在人工養(yǎng)殖過(guò)程中容易受水質(zhì)、細(xì)菌和病毒的感染等而導(dǎo)致養(yǎng)殖過(guò)程中存活率低,從而給擬穴青蟹的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失。雖然已經(jīng)有不少的應(yīng)對(duì)策略如免疫增強(qiáng)劑等,但如何通過(guò)提高擬穴青蟹自身的免疫力來(lái)抵抗日益嚴(yán)重的病害已成為目前蟹類養(yǎng)殖業(yè)中一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。關(guān)于擬穴青蟹免疫相關(guān)基因的研究近年來(lái)也逐漸增多,在研究過(guò)程中對(duì)基因表達(dá)譜的分

2、析是探究基因功能的重要方法之一,主要通過(guò)熒光定量 PCR(real-time quantitative PCR,Real-time qPCR)技術(shù)利用PCR體系中添加的特定熒光基團(tuán),對(duì)目的基因產(chǎn)物的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。為了獲得真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在此過(guò)程中通常引入內(nèi)參基因以消除不同樣品在樣本量、樣本質(zhì)量以及反轉(zhuǎn)錄效率,進(jìn)行數(shù)據(jù)校正和標(biāo)準(zhǔn)化。
　　本論文擬從分子生物學(xué)的角度,借助熒光定量PCR技術(shù)和GeXP多重PCR技術(shù),對(duì)擬穴青蟹不

3、同組織中及細(xì)菌感染條件下部分免疫相關(guān)基因及內(nèi)參基因的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行了表達(dá)模式分析,探討了免疫相關(guān)基因在青蟹免疫過(guò)程中的作用,并對(duì)不同內(nèi)參基因在各組織中及細(xì)菌感染條件下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析,為擬穴青蟹免疫相關(guān)基因的研究提供必要的理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的克隆和表達(dá)譜分析
　　巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MI

4、F)是一種發(fā)現(xiàn)較晚的功能多樣化的細(xì)胞因子。運(yùn)用克隆測(cè)序從擬穴青蟹的肝胰腺cDNA文庫(kù)中分離得到了一條cDNA序列,通過(guò)Mega軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn),這條cDNA序列與其他物種巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因之間具有較高的同源性,經(jīng)綜合分析確定為巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因(SpMIF)。擬穴青蟹MIF cDNA由734 bp的堿基組成,包含一個(gè)363 bp的開放閱讀框,編碼一個(gè)分子量約為13.46 kDa、等電點(diǎn)約為6.82的由120個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白

5、質(zhì)。該基因編碼的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子蛋白與中華絨螯蟹的該蛋白序列有68％的相似度。運(yùn)用 Quantitative real-time PCR技術(shù)研究了MIF基因在擬穴青蟹肝胰腺、血液、心臟、肌肉、精巢和鰓6個(gè)組織中的表達(dá)差異,使用18S rRNA作為內(nèi)參引物,檢測(cè)結(jié)果顯示在6個(gè)組織中該基因均有表達(dá),其中在肝胰腺和血液中的表達(dá)量最高。用副溶血性弧菌注射成體擬穴青蟹,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SpMIF表達(dá)量明顯提升,在8h后達(dá)到最高值,隨后緩緩下降,到4

6、8 h恢復(fù)正常水平?？梢?經(jīng)弧菌刺激后MIF在血液中有較快的釋放。本實(shí)驗(yàn)證明巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子可能在擬穴青蟹的免疫和抗菌過(guò)程中具有重要作用,為深入研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
　　2.擬穴青蟹C型凝集素受體的克隆和表達(dá)譜分析
　　C型凝集素受體是C型凝集素家族的一員,參與生物體內(nèi)的多項(xiàng)生理過(guò)程。本研究在擬穴青蟹cDNA文庫(kù)獲得一條C型凝集素受體的cDNA全長(zhǎng)序列,命名為SpCLR。SpCLR全長(zhǎng)為697 bp,包含po

7、ly(A)結(jié)尾,開放閱讀框長(zhǎng)度為510 bp,編碼一個(gè)含有169個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)該蛋白分子的量為19.236 kDa,等電點(diǎn)為4.57。使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SpCLR在所檢測(cè)的肝胰腺、血液、心臟、精巢、鰓和肌肉六個(gè)組織中均有表達(dá),肝胰腺中表達(dá)量最高,檢測(cè)時(shí)使用elongationfactor1α和18SrRNA作為內(nèi)參基因。使用副溶血性弧菌對(duì)成體處理后,發(fā)現(xiàn)血液中SpCLR的表達(dá)量從8 h檢測(cè)到上升,到12 h檢測(cè)到

8、最高值,檢測(cè)時(shí)使用elongationfactor1α、18SrRNA和ubiguitin作為內(nèi)參基因。說(shuō)明SpCLR在肝胰腺中發(fā)揮重要作用,并能對(duì)弧菌刺激進(jìn)行免疫應(yīng)答。C型凝集素參與大量的先天免疫防御和細(xì)胞連接反應(yīng),本研究對(duì)了解擬穴青蟹的免疫系統(tǒng)具有重要的參考價(jià)值。
　　3.擬穴青蟹免疫相關(guān)基因表達(dá)定量PCR分析中內(nèi)參基因的適用性分析
　　以擬穴青蟹6個(gè)不同組織(肝胰腺、血液、心臟、肌肉、精巢和鰓)及副溶血性弧菌(Vibi

9、o Parahaemolyticus)刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12、24、48和72 h)的血液樣本為研究對(duì)象,應(yīng)用GeXP技術(shù)檢測(cè)探討β-actin、16SrRNA、18SrRNA、28SrRNA、α-Itubulin、GAPDH、ribosomalproteinL13、elongation factor1α、elongationfactor2、arininekinase和ubiguitin共11種不同內(nèi)參基因mRNA水平的表達(dá)

10、情況。使用geNorm和NormFinder軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示,在6個(gè)不同的組織中,18SrRNA、elongationfactor1α、β-actin、ubiguitin、GAPDH和α-Itubulin六種內(nèi)參基因穩(wěn)定性較高,可以作為內(nèi)參基因使用,其中以elongationfactor1α和18SrRNA表達(dá)穩(wěn)定性最好,推薦共同作為內(nèi)參基因使用;經(jīng)副溶血性弧菌刺激后的血液樣本中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示elongationfactor1

11、α、ubiguitin、18SrRNA表達(dá)穩(wěn)定性最高,推薦以此三個(gè)基因共同作為內(nèi)參,對(duì)相對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。本研究對(duì)擬穴青蟹功能基因的定量分析研究提供了參考依據(jù)。
　　綜上所述,本研究克隆得到了兩個(gè)與擬穴青蟹免疫相關(guān)基因的cDNA序列,運(yùn)用Quantitative real-time PCR技術(shù)研究了它們?cè)跀M穴青蟹不同組織以及經(jīng)過(guò)免疫刺激后不同時(shí)間的差異表達(dá)模式;對(duì)擬穴青蟹11個(gè)候選內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)設(shè)置下的適用性進(jìn)行了分析,為今