1、Toll受體是一種重要的模式識別受體,在天然免疫過程中起著識別病原物并觸發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的作用,被視為天然免疫向特異性免疫過渡的橋梁。目前人們已在果蠅中發(fā)現(xiàn)9種Toll樣受體,在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)13種Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)。然而迄今為止,擬穴青蟹是否具有TLRs,國內(nèi)外尚無報道。為此,本研究采用分子生物學(xué)、免疫學(xué)的方法,對擬穴青蟹中的Toll樣受體(SpToll)及其性質(zhì)進行了深入的研究,所獲

2、研究結(jié)果具體如下:
　　1、SpToll基因克隆及生物信息學(xué)分析
　　采用簡并PCR結(jié)合RACE技術(shù),首次在擬穴青蟹體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并克隆得到Toll樣受體同源基因SpTollcDNA全序列,其cDNA全長3843bp,開放讀碼框為3018bp,編碼1006個氨基酸,預(yù)測該多肽具有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,是一種跨膜蛋白。經(jīng)BLAST比對,SpToll基因與多種節(jié)肢動物Toll受體蛋白高度同源,與日本對蝦MjToll、凡納濱對蝦LvTol

3、l和果蠅DmToll的序列相似性分別達到43％、39%和32%。SpToll具有典型的Toll樣受體結(jié)構(gòu):包括胞外富亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeats,LRRs),跨膜區(qū)和胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-1 receptor homologous region),糖基化位點預(yù)測發(fā)現(xiàn),SpToll胞外區(qū)有14個潛在的N糖基化位點。該研究結(jié)果證實了擬穴青蟹中Toll樣受體的存在,為深入了解青蟹免疫機制奠定了良好

4、的基礎(chǔ)。
　　2、SpToll mRNA組織特異性表達及病原相關(guān)分子模式研究
　　RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)SpToll基因在心、鰓、肝、胃、腸、肌肉、眼柄和血細胞中廣泛表達,未發(fā)現(xiàn)明顯的組織表達特異性。Real-time PCR研究顯示,青蟹血細胞SpToll基因mRNA表達豐度在注射副溶血弧菌3h后顯著下調(diào),然后逐漸上升,至48h上調(diào)極顯著,達到0h表達量的2.5倍;LPS注射3h后,該基因表達豐度相對于對照組下調(diào)極顯著,至4

5、8h仍處于下調(diào)顯著水平;而PolyI:C注射組青蟹血細胞SpToll基因表達豐度與對照組相比差異不顯著。這預(yù)示著青蟹SpToll基因可能參與抵抗細菌類病原物入侵的免疫應(yīng)答。
　　3、SpToll LRRs區(qū)SNPs(single nucleotide polymorphisms)多態(tài)性及病原識別相關(guān)性分析
　　為了進一步探索SpToll識別病原微生物的分子基礎(chǔ),我們選取SpToll病原相關(guān)分子模式識別區(qū)LRRs,采用PCR-

6、DGGE技術(shù)、構(gòu)建質(zhì)粒文庫結(jié)合目的基因重測序技術(shù),進一步對其SNPs多態(tài)性及病原識別相關(guān)性進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SpToll基因LRRs區(qū)存在到大量的SNPs位點,平均每個個體DNA水平為55個,cDNA水平為61個,多數(shù)位點豐度較低,突變頻率約為1%～4%。有意思的是,我們同時在SpToll基因胞外區(qū)LRR13的插入序列(438-451)發(fā)現(xiàn)一個突變率達50%以上的高頻突變位點1847,其cDNA序列由A突變?yōu)镚(c.1847A>G

7、),所編碼氨基酸由賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?突變類型為錯義突變。經(jīng)生物信息學(xué)分析,該突變可導(dǎo)致SpToll二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,提示該位點可能與SpToll特異性識別病原微生物有關(guān)。
　　在此基礎(chǔ)之上,進一步采用PCR產(chǎn)物測序技術(shù)對c.1847A>G位點不同基因型在群體中的分布規(guī)律進行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種基因型在群體中比例相差較大,野生型(A/A)占55%,雜合型(A/G)占33%,突變型(G/G)占12%。等位基因c.1847A的頻率為

8、0.7143,c.1847G的頻率為0.2857,X2檢驗結(jié)果顯示該位點屬于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。其群體雜合度為0.5918,PIC為0.3249,表明該基因座位屬于中度多態(tài),提示擬穴青蟹群體內(nèi)遺傳變異較大,該位點(c.1847A>G)有望作為一種新的分子標(biāo)記用于抗逆優(yōu)良青蟹的篩選。
　　綜上所述,本研究主要發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹中存在Toll受體同源基因SpToll,其可能主要參與識別、抵抗細菌類病原物入侵的免疫應(yīng)答。所獲