1、抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMPs）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)、在生物遭受外界異物或病原微生物刺激時能快速產(chǎn)生的小分子多肽。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有多種生物學活性，它不僅對病原微生物如細菌、真菌、病毒和原蟲等具有廣譜的殺滅作用，還能抑殺癌變細胞、調節(jié)機體免疫等。抗菌肽以其廣譜、安全且無耐藥等生物學特點，有可能被開發(fā)成為一種新型的抗生素來替代傳統(tǒng)抗生素在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領域應用。本課題的研究對象抗菌肽Oncorhyn

2、cinⅡ分離自虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)的表皮分泌物中，它是由69個氨基酸殘基組成，分子量約為7.2kDa，等電點為12.96，具有較強的穩(wěn)定性，在微摩爾濃度下便能抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，而且在發(fā)揮抗菌活性的同時并未出現(xiàn)溶血作用。本課題研究借助基因工程技術構建生產(chǎn)來源于虹鱒魚表皮分泌物中的抗菌肽OncorhyncinⅡ的畢赤酵母生產(chǎn)菌株，并將其發(fā)酵后進行分離純化以獲得高純度的目的多肽，最后初步探究抗菌

3、肽OncorhyncinⅡ的抗菌機制。
　　 1畢赤酵母（Pichia pastoris）表達載體及工程菌株的構建
　　 采用RT-PCR的方法從虹鱒魚的表皮中獲得抗菌肽OncorhyncinⅡ的cDNA序列，并將其克隆至載體pGEM(R)-TEasy上，然后測序驗證序列的正確性。根據(jù)抗菌肽OncorhyncinⅡ的基因序列設計上下游引物，以OncorhyncinⅡ/pGEM(R)-TEasy為模板，進行PCR擴增，以獲

4、得目的片段。將獲得的目的片段和載體分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，最后成功構建出畢赤酵母表達質粒pGAOnⅡ。將重組表達質粒pGAOnⅡ和質粒pGAPZαA經(jīng)BlnⅠ線性化處理后電擊轉化入畢赤酵母GS115中，在含有Zeocin TM的YPDS培養(yǎng)基上篩選獲得抗性轉化子。在含有1000μg/mL ZeocinTM的YPDS培養(yǎng)基上得到高拷貝轉化子，經(jīng)過PCR驗證，獲得了高拷貝的陽性轉化子

5、。將高拷貝的陽性轉化子培養(yǎng)后用Tricine-SDS-PAGE檢測目的多肽的表達，目的條帶與預期的分子量一致，結果表明重組表達的抗菌肽OncorhyncinⅡ成功被分泌至胞外。發(fā)酵液上清中的抑菌活性分析表明，重組抗菌肽OncorhyncinⅡ具有一定的抗菌活性，它對革蘭氏陽性菌的抑制作用明顯強于對革蘭氏陰性菌及真菌的抑菌作用。對發(fā)酵液上清中抗菌肽OncorhyncinⅡ的穩(wěn)定性研究表明，抗菌肽OncorhyncinⅡ具有較強的熱穩(wěn)定性，

6、且能耐受反復凍融的處理。
　　 2抗菌肽OncorhyncinⅡ的分離純化及性質研究
　　 首先采用陽離子交換樹脂SP Sepharose Fast Flow對發(fā)酵液中的抗菌肽進行分離純化，用Tricine-SDS-PAGE檢測，結果發(fā)現(xiàn)2號洗脫峰存在目的多肽OncorhyncinⅡ，且雜蛋白的分子量在1.5kDa以上。第二步選擇10kDa的超濾膜分離系統(tǒng)，將分子量較大的雜蛋白截留，而小于10kDa的目的多肽和大部分鹽分

7、被濾出。將截留液和濾出液進行Tricine-SDS-PAGE檢測，結果與預期相同，目的多肽被保留于濾出液中。最后用1kDa的透析袋透析脫鹽，凍干后得到抗菌肽OncorhyncinⅡ純品。高純度的抗菌肽OncorhyncinⅡ仍然具有明顯的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.54μg/L。
　　 3抗菌肽OncorhyncinⅡ的抗菌機制研究
　　 選用金黃色葡萄球菌最為受試菌株，首先研究抗菌肽Oncorhync

8、inⅡ的抑菌動力學。觀察抗菌肽OncorhyncinⅡ對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響，結果發(fā)現(xiàn)OncorhyncinⅡ對金黃色葡萄球菌的抑制作用迅速、高效，且與作用時間呈正相關。觀察抗菌肽OncorhyncinⅡ對金黃色葡萄球菌細胞通透性的影響，結果表明抗菌肽可導致細菌細胞的通透性增強，可能以菌體內(nèi)容物泄露的方式導致細菌的死亡。其次采用活細胞工作站和透射電鏡技術觀察抗菌肽OncorhyncinⅡ作用于金黃色葡萄球菌的形態(tài)變化。
　

9、　 本研究取得的主要研究成果有：
　　 1.成功構建了抗菌肽OncorhyncinⅡ畢赤酵母分泌表達質粒pGAOnⅡ，并采用畢赤酵母表達系統(tǒng)對OncorhyncinⅡ進行分泌表達，獲得了具有抗菌活性強、穩(wěn)定性好的重組表達產(chǎn)物。
　　 2.成功建立重組抗菌肽OncorhyncinⅡ的分離純化工藝，最終獲得了純度較高、活性和穩(wěn)定性較好的抗菌肽OncorhyncinⅡ。
　　 3.初步探究了抗菌肽Oncorhynci