1、許多傳統(tǒng)的抗生素具有毒副作用且能夠誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生，甚至出現(xiàn)了能夠耐受幾乎所有抗生素的“超級(jí)細(xì)菌”，致使一些抗生索療效降低，甚至無(wú)效。世界衛(wèi)生組織在1994年就已宣布，抗生素的使用將成為全世界醫(yī)療衛(wèi)生的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題[l]。細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題推動(dòng)了人們尋求新型抗菌藥物的決心。
　　 抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是由生物體基因編碼的一類(lèi)具有抗菌活性的小分子多肽，是宿主先天性非特異性防御系統(tǒng)的重要組

2、分[2，3]，具有非特異性抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體作用[4,5]，還有研究表明，抗菌肽無(wú)致畸作用且不易發(fā)生蓄積中毒。因此，抗菌肽成為最具開(kāi)發(fā)前景的抗生素替代品。
　　 蛔蟲(chóng)寄生在動(dòng)物和人體富含細(xì)菌的腸道內(nèi)，提示蛔蟲(chóng)有某種抗菌機(jī)制，近年來(lái)國(guó)外學(xué)者從其體內(nèi)分離到cecropin類(lèi)抗菌肽[2]，顯示有廣譜的殺菌作用，抗菌譜主要包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)病毒、腫瘤細(xì)胞、原蟲(chóng)、真菌也有一定的抑制作用。而且耐高溫，100℃加熱仍能

3、保持一定的活性。Lee等首先從豬小腸分離得到cecropin P1，含31個(gè)氨基酸，后來(lái)證實(shí)是由蛔蟲(chóng)(Ascaris suum)在抵抗微生物時(shí)分泌的。Pillai等(2005)利用cDNA差異顯示技術(shù)對(duì)蛔蟲(chóng)(Ascarissuum)cDNA研究，測(cè)定了編碼cecropin P1的基因序列，同時(shí)又發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的蛔蟲(chóng)抗菌肽基因，分別命名為cecropins P2、P3和P4，化學(xué)合成這些短肽，發(fā)現(xiàn)其有廣譜抗菌活性，其中尤以cecropin

4、Pl殺菌活性最強(qiáng)。
　　 由于蛔蟲(chóng)是動(dòng)物和人體內(nèi)的寄生蟲(chóng)，獲得大量的抗菌肽十分的困難，基因工程領(lǐng)域的飛速發(fā)展，為大量獲得蛔蟲(chóng)抗菌肽提供了兩全其美的方案。由于抗菌肽對(duì)工程菌有毒性，必須采用融合表達(dá)和酵母表達(dá)策略，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)此研究取得了可喜的進(jìn)展，多種來(lái)源的抗菌肽基因在大腸桿菌和酵母菌中表達(dá)成功，表達(dá)產(chǎn)物具有生物學(xué)活性，說(shuō)明本研究路線是可行的。在本文中，我們期望通過(guò)分析以蛔蟲(chóng)為主的抗菌肽的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)、合成一段多肽并使其在畢赤

5、酵母表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)，期望能夠獲得具有抗菌活性的轉(zhuǎn)基因酵母菌株，獲得大量有活性抗菌肽用于研究應(yīng)用當(dāng)中.初步探索蛔蟲(chóng)cecropin P1生物活性，為日后獲得抗菌活性更高、抗菌譜更廣的抗菌肽打下一定的基礎(chǔ)。
　　 目的應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究蛔蟲(chóng)抗菌肽cecropinP1及其體內(nèi)外抗菌活性，為重組抗菌肽cecropinP1的工程化生產(chǎn)以及公共衛(wèi)生健康服務(wù)奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)基因工程獲得cecropin P1抗菌肽希望給社

6、會(huì)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益。
　　 方法在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)蛔蟲(chóng)抗菌肽cecropin P1并檢測(cè)其生物活性，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，人工設(shè)計(jì)并合成3條cecropin P1基因寡核苷酸片段，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到cecropin P1基因，構(gòu)建重組載體pMD18-T-cecPl。雙酶切pMD18-T-cecP1，將cecropin P1基因克隆到載體pPICZα-A信號(hào)序列α-因子之后，構(gòu)建酵母分泌表達(dá)載體pPICZα-A-cecPI

7、，用Sac I將其線性化后，采用電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，采用Zeocin抗性篩選陽(yáng)性菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得酵母分泌表達(dá)載體pPICZα-A-cecP1。獲得的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳、應(yīng)用紙片法抑菌實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的抑菌活性，進(jìn)一步測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。
　　 結(jié)果 SDS-PAGE證實(shí)pPICZα-A-cecPl/X-33甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)物的分子質(zhì)量單位為6.3ku，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸埃希菌DH5α的生長(zhǎng)有抑

8、制作用。初步抑菌活性測(cè)定顯示其對(duì)大腸桿菌DH5α、嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌CMCC50222和志賀氏菌SDCDC563有明顯的抑制作用，但對(duì)銅綠假單胞菌27853沒(méi)有抑菌圈的產(chǎn)生。誘導(dǎo)表達(dá)上清液對(duì)骨髓瘤細(xì)胞SP2/O有明顯的抑制生長(zhǎng)作用，抑制率最大為74-845％，IC50為87.181μg/ml。對(duì)杜氏利什曼原蟲(chóng)也有明顯的抑制生長(zhǎng)作用抑制率最大為85.381％，IC5o為37.333μg/ml。
　　 結(jié)論成