1、METH-1是一種新發(fā)現(xiàn)的具有抗血管生成和抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的蛋白質(zhì).METH-1基因最初是以TSP1具有抗血管生成活性區(qū)域序列的EST為探針,從成年人心臟cDNA文庫(kù)中分離得到的.本研究利用PCR技術(shù)從人胎腦cDNA文庫(kù)中釣取METH-1 cDNA,并對(duì)其進(jìn)行改造去除了METH-1基因中自身的信號(hào)序列,在5'端引入了24個(gè)堿基,其中包括畢赤酵母信號(hào)肽酶識(shí)別序列的編碼序列和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn).將改造好的METH-1基因克隆到質(zhì)粒pBl

2、uescript M13上,對(duì)包含以上24個(gè)堿基的前0.88kb進(jìn)行了序列測(cè)定,結(jié)果顯示,序列與編碼畢赤酵母信號(hào)肽酶識(shí)別序列24個(gè)堿基序列及公開(kāi)報(bào)道的METH-1相應(yīng)序列一致.然后,將去除了自身信號(hào)序列的METH-1基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上,獲得重組質(zhì)粒pPIC-METH-1.將重組質(zhì)粒pPIC-METH-1用Sal Ⅰ線性化后,電激法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得GS115(pPIC-METH-1),進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).SDS

3、-PAGE電泳顯示,GS115(pPIC-METH-1)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后在出現(xiàn)一條約68 kDa大小的新的蛋白帶,而轉(zhuǎn)化了pPIC9K空載體的GS115的泳道上沒(méi)有這條蛋白帶,表明METH-1基因已在GS115(pPIC-METH-1)中獲得表達(dá).在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行了高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選、產(chǎn)物的純化及生物活性分析.最后,分別用CAM實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)證明了純化產(chǎn)物的生物活性,發(fā)現(xiàn)在10 μ g/胚的條件下重組METH-1能抑制bFGF誘導(dǎo)的雞胚絨