1、目的:
　　 為了研究人成骨細胞刺激因子(human osteoblast-stimulating factor, OSF-1)的生物學(xué)活性，本實驗誘導(dǎo)重組畢赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9k-osf-1分泌表達重組人成骨細胞刺激因子，并對該蛋白進行鑒定、純化及其生物活性的測定。
　　 方法:
　　 1.重組人OSF-1蛋白的表達①于YPD培養(yǎng)基挑選重組畢赤酵母菌（P.pastorisGS11

2、5/pPIC9k-osf-1）單菌落于30℃90 mL BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=4。②室溫離心培養(yǎng)液，重懸菌體于300 mL BMMY培養(yǎng)基至OD600=1。③25℃誘導(dǎo)，每24 h向培養(yǎng)基添加甲醇至濃度1.0％，按0h、12h、24 h、36h、48 h、72 h、96 h、120 h分別取發(fā)酵液，離心取上清，SDS-PAGE分析蛋白表達。④SDS-PAGE后濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100V1 h，將PVDF膜浸入

3、封閉液，室溫中封閉1h，加一抗羊抗OSF-1抗體，室溫孵育1h，TBST洗膜3遍，加二抗辣根酶標記的兔抗山羊抗體，溫室孵育1.5 h，TBST洗膜3遍，加DAB/Nicl2液，暗環(huán)境下顯影。⑤Bradford法定量發(fā)酵液中的目標蛋白。
　　 2.重組酵母表達蛋白OSF-1的純化①細菌最佳表達時間收集發(fā)酵液上清，發(fā)酵液初分離。②于4℃磷酸緩沖液中透析20 h，每4h更換一次磷酸緩沖液。⑨雙蒸水洗SP-Sephadex C-50樹脂

4、4遍，用緩沖液（pH7.6，20 mmol/L磷酸緩沖液）洗樹脂4遍。④樹脂真空除氣、裝柱，磷酸緩沖液以1.0 ml/min的流速平衡柱子，上樣，洗脫液（20 mmol/L磷酸緩沖液，2 mol/L NaCL，pH7.6）洗脫蛋白，用Ep管收集洗脫蛋白。⑤各取收集管中洗脫蛋白40μL，處理后行不連續(xù)SDS-PAGE分析，根據(jù)電泳結(jié)果收集洗脫蛋白。⑥洗脫下的蛋白經(jīng)超濾(10000 rpm，20 min)濃縮除鹽后，行SDS-PAGE、We

5、stern-blot鑒定、Bradford法定量蛋白。
　　 3.純化蛋白OSF-1生物活性測定 CCK-8法測定細胞增殖①配制常規(guī)培養(yǎng)液，配制陰性對照組培養(yǎng)液(90％ MEM EARLES培養(yǎng)基+10％胎牛血清+雙抗1mL)、實驗組hrOSF-1處理組培養(yǎng)液（常規(guī)培養(yǎng)液中各加不同濃度hrOSF-1，使培養(yǎng)液中hrOSF-1濃度分別為0.1μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL）、陽性對照組培養(yǎng)液（常規(guī)培養(yǎng)液中加PTH

6、，使培養(yǎng)液中PTH濃度為0.041178μg/mL）。②制備鼠成骨細胞MC3T3-E1單細胞懸液，每孔5×103個/mL接種于96孔板，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。③吸去原有培養(yǎng)液，分別各加入不同濃度的OSF-1實驗組培養(yǎng)液、陽性對照組培養(yǎng)液、陰性對照組培養(yǎng)液各100μL，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，每24 h換一次液體，連續(xù)培養(yǎng)3d，觀察各組鼠成骨細胞MC3T3-E1的生長情況。④培養(yǎng)至第3d時，每孔加入10μL的CC

7、K-8，放于CO2培養(yǎng)箱中孵育3h，酶標儀450nm測定OD值，觀察表達蛋白對鼠成骨細胞MC3T3-E1的增殖作用。PNNP法測定細胞分化①鼠MC3T3-E1細胞以每孔2×104個/ml種24孔板，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②吸去原有培養(yǎng)液，分別各加入實驗組OSF-1處理組培養(yǎng)液（常規(guī)培養(yǎng)液中各加不同濃度OSF-1，使培養(yǎng)液中hrOSF-1濃度分別為0.1μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL)、陽性對照組培養(yǎng)

8、液（常規(guī)培養(yǎng)液中加PTH，使培養(yǎng)液中PTH濃度為0.041178μg/mL）、陰性對照組培養(yǎng)液各400μL，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，每24 h換一次液體，連續(xù)培養(yǎng)3d，觀察各組成骨細胞的生長情況。③培養(yǎng)至第3d時，吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，每孔加入200μL的TritoX-100裂解液，50 min待細胞完全裂解，吸取裂解液、酚標準應(yīng)用液、雙蒸水各30μL于96孔板，向其中分別加入緩沖液及基質(zhì)液各50μL，水浴15 min

9、，加入顯色劑150μL。④酶標儀492 nm測定OD值，觀察表達蛋白誘導(dǎo)鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞分化的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.SDS-PAGE顯示在分子量為18kDa附近出現(xiàn)特異性蛋白條帶，此條帶與預(yù)測的OSF-1蛋白的分子量大小相符合，該蛋白在96 h表達量最大。經(jīng)Western-bot檢測純化的目的蛋白能與OSF1抗體結(jié)合。Bradford法定量發(fā)酵液OSF-1蛋白濃度為86.27μg/mL。
　

10、　 2.最佳表達時間收集發(fā)酵液，采用離子交換層析方法，經(jīng)SP-Sephadex C-50樹脂純化，SDS-PAGE檢測在18 kDa附近可見清晰蛋白條帶，經(jīng)Western-bot檢測純化的目的蛋白能與OSF-1抗體結(jié)合。通過該純化工藝，可獲得純度大于98％的OSF-1蛋白。
　　 3.通過CCK-8法觀察鼠成骨細胞MC3T3-E1的增殖，結(jié)果顯示OSF-1處理組的細胞增殖OD值高于陰性對照組(P＜0.05)，呈濃度時效依賴性，

11、在OSF-1為0.1μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL處理的細胞增殖OD值以1.0μg/mL濃度的增殖作用最大，且較甲狀旁腺激素處理組高。通過PNPP法測定堿性磷酸酶活性來觀察鼠成骨細胞MC3T3-E1的分化，結(jié)果顯示OSF-1處理組成骨細胞堿性磷酸酶活性顯著高于陰性對照組(P＜0.05），但低于甲狀旁腺激素組，OSF-1處理組誘導(dǎo)細胞分化呈濃度依賴性，隨著濃度增加，堿性磷酸酶活性增高，1.0μg/mL增高較顯著，雖然10